茶树草螺菌WT00C-Se发酵制备红色纳米单质硒

田金宝,雷佳,周佳卉,倪雪晨,陈昌梅,王行国

(湖北大学生命科学学院, 湖北 武汉 430062)

0 引言

硒是一种动植物必需的微量非金属元素.在自然界，硒常常以无机和有机形式存在.硒的有机形式通常存在动植物细胞内，如硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸以及硒蛋白.无机硒通常有4种价态: 硒酸盐(Se6+)，亚硒酸盐(Se4+)，硒化物(Se2-)和单质硒(Se0)[1].其中Se2-常作为各种生物制造硒蛋白的原料且具有挥发性[2].硒酸盐(Se6+)和亚硒酸盐(Se4+)是水溶性的，在环境中具有潜在的移动性和生物可利用性[3].虽然Se6+吸附能力较弱，但其潜在的活性和生物利用率比Se4+要高[4].在含氧环境中，Se6+和Se4+占有优势，但浓度偏高时对生物呈现较强的生物毒性.在还原环境中，Se0更趋于热力学稳定但水溶性较差.单质纳米硒具有高生物活性、低毒性和高光电导率[5].利用单质纳米硒特定的物理性质，人们已在光电、半导体、X 线感测等方面应用.由于拥有高表面积和体积，单质纳米硒具有较强的吸附力和抗氧化功能，如抗羟自由基功效、抗DNA氧化作用以及抗微生物活性等[6].它们的生物反应性显示出单质纳米硒在免疫调节、抗氧化、延缓衰老、抑制肿瘤、治疗微生物感染方面的应用潜力.单质纳米硒体外清除羟基自由基的效率为无机硒的5倍、有机硒的2.5倍、其毒性仅为亚硒酸钠的1/7.

目前，单质纳米硒主要通过物理化学方法制备，如使用水热/溶剂热合成法、微波法、脉冲激光烧蚀、气相沉积法、模板法和自组装等方法制备硒纳米材料[7].鉴于物理化学方法的非环境友好问题，人们开始利用化学-生物质或微生物方法制备单质纳米硒.但目前尚处在研究开发阶段.化学-生物质方法的缺点主要是生物质获取的成本高，不宜规模化生产.利用微生物方法制备单质纳米硒虽然可行.但大多数微生物如大肠杆菌、罗尔斯通氏菌、深红红螺菌、荚膜红细菌、荧光假单胞菌、固氮红细菌等对硒酸钠或亚硒酸钠的耐受性低.仅见一株固氮红细菌耐受高达125 mmol/L亚硒酸钠.且能将亚硒酸钠还原为红色单质硒，但高于此浓度它就无法生长[8-9].因此，开发新的微生物方法制备单质纳米硒是当前广受关注的重要课题，也是实现环境友好、低成本、规摸化生产的有效途径.

图1 茶树内生草螺菌硒酸盐还原生成红色单质硒的代谢途径

茶树内生草螺菌WT00C和WT00F是本实验室从野外观赏茶树中分离的两株革兰氏阴性内生细菌.并且在实验室里实现了规模化培养[10].茶树内生草螺菌WT00C全基因组测序[11]发现它拥有硒酸盐还原途径，即通过腺苷酰硫酸焦磷酸化酶将硒酸盐还原成亚硒酸盐后，再经过谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶将其还原为谷胱甘肽-硒醇并最终生成零价的单质硒(图1).前期研究证明，茶树内生草螺菌能利用硒酸盐还原途径合成红色单质硒[12].茶树内生草螺菌不仅在低硒酸盐浓度下还原硒酸盐.而且,能在高达800 mmol/L硒酸盐中也能还原硒酸盐生成红色单质硒.只是硒酸盐浓度越高，它的生长抑制期越长，即细菌生长周期耗时越久.例如,当硒酸盐浓度为75 mmol/L时,茶树内生草螺菌生长抑制期大约为7 h.而硒酸盐浓度为200 mmol/L时,它的生长抑制期为12 h[12].由于红色单质硒产率依赖硒酸盐浓度，硒酸盐浓度越高，红色单质硒产率也越高.因此,本研究的目的是开发出一种能在高硒酸盐浓度条件下有效生产红色单质硒的菌株,并实现规模化生产.本研究报道如何获取茶树内生草螺菌WT00C-Se,并利用它在200 mmol/L硒酸盐浓度条件下生产红色单质硒的方法，为细菌生产红色单质硒提供了一种全新的思路，也为后续产业化提供了技术支撑.

1 材料与方法

1.1 细菌菌株与培养茶树草螺菌WT00C由本实验室分离并保存.茶树草螺菌WT00C-Se来自200 mmol/L硒酸钠LB培养基37 ℃培养28 h 的茶树草螺菌WT00C.参照文献[10],细菌日常在含有5 μg/mL壮观霉素和10 μg/mL 氨苄青霉素的营养肉汤(NB)培养基(蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、加水至1 L, pH 7.2)中34 ℃培养，-80 ℃贮存.放大培养时，先用NB培养基活化，再用LB 培养基(胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g、加水至1 L, pH 7.2)37 ℃培养.

1.2 200 mmol/L 硒酸盐条件下茶树草螺菌生长曲线的测定取-80 ℃冻存的茶树草螺菌，划线涂布在含有5μg/mL壮观霉素和10 μg/mL氨苄青霉素的NB固体培养基上，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h 后，挑取单菌落并接种于5 mL NB液体培养基中，置于37 ℃、200 r/min摇床中活化过夜.将过夜活化培养至OD600值为0.6.按照1∶100比例转接至100 mL的含200 mmol/L 硒酸钠的LB液体培养基中培养，每隔两小时取样并检测OD600值，根据测得的数值绘制生长曲线.同时,将茶树草螺菌WT00C接种至不含硒酸钠的LB培养基中培养并用作参照.每个点的数值为3次实验数据的平均数，标准误为≤10%.

1.3 茶树草螺菌WT00C-Se硒酸钠还原活性测试参考文献[12]报道的方法,取茶树草螺菌WT00C-Se并按1∶100比例接种至含0、50、75、100、150、200 mmol/L硒酸钠的200 mL LB培基中，37 ℃、200 r/min摇床培养18 h.肉眼观察培养基颜色变化.

1.4 茶树草螺菌WT00C-Se红色单质硒产率条件优化首先按1∶100比例接种草螺菌WT00C-Se至含0、10、25、75 mmol/L 硒酸钠的LB培养基中,恒温摇床37 ℃,200 r/min活化.待OD600值为0.8时，再将4种活化的细菌按1∶100的比例分别接种于含150 mmol/L 和200 mmol/L 硒酸钠 的LB液体培养基中.每个样品设3次重复，每瓶总体积为200 mL，共72瓶.接种后仍在恒温摇床 37 ℃,200 r/min条件下培养.为了消除细菌生长的差异引起的误差,首先待所有样品中细菌的OD600值为1.0,再分别计时培养12 h和24 h,并分别在这3个时间点取样纯化红色单质硒.最后称重计算产率并进行比较.

1.5 发酵罐发酵首先按1∶100比例接种茶树草螺菌WT00C-Se至含75 mmol/L 硒酸钠的LB培养基中,恒温摇床37 ℃、200 r/min活化至OD600值为0.8.在5 L发酵罐(BIOTECH, 上海保兴)中加入3 L LB 液体培养基并按厂家要求消毒灭菌.然后，加入硒酸钠至终浓度200 mmol/L, 再按1∶100的接种量接入30 mL活化的细菌种子液,并按优化条件在37 ℃、200 r/min发酵35 h.发酵停止后，收集发酵罐内的细菌溶液.

1.6 纳米硒球制备参考文献[12]报道的方法，将收集的细菌培养物转移至离心管中，1 000 r/min离心10 min并收集上清.上清液再经10 000 r/min 离心10 min，收集沉淀并用无菌的1 mol/L PBS 缓冲液重悬沉淀.尔后再经无菌的50%～70%蔗糖密度梯度15 000 r/min 离心20 min.小心吸取50%蔗糖和70%蔗糖中间的红色区带，并用无菌的100 mmol/L PBS 缓冲液重悬.转移至新的蔗糖密度梯度溶液上再离心一次.吸取的红色区带用无菌的100 mmol/L PBS 缓冲液重悬后，10 000 r/min离心10 min并收集沉淀.重复这一过程两次.得到纯净的纳米硒球.

1.7 红色纳米单质硒制备收集菌液于500 mL 离心瓶中，4 ℃、1 000 r/min离心两次，每次10 min.收集上清部分并除去细菌沉淀.4 ℃、8 000 r/min离心上清部分30 min并收集沉淀物.用生理盐水离心洗涤(4 ℃、12 000 r/min、8 min)3次后，用生理盐水重悬沉淀物并混匀.在冰浴、功率为100 W的条件下超声处理重悬液10 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min并收集沉淀物.用1.5 mol/L Tris-HCl、1%SDS(pH 8.3)离心洗涤(4 ℃、12 000 r/min、8 min)沉淀物两次，最后用无菌水洗涤1次.用无菌水重悬沉淀物后，按V重悬液∶V正辛醇=2∶1的比例加入正辛醇.充分混匀后，4 ℃、12 000 r/min 离心8 min并置于4 ℃ 24 h.小心移去全部液体后，沉在离心管底部纳米硒颗粒(SeNPs)分别用氯仿、乙醇和无菌水12 000 r/min 离心8 min各洗涤一次以除去蛋白杂质.最后使用真空冷冻干燥仪(LGJ-10, 北京松源华兴)干燥获得的红色单质硒.称重后储存于4 ℃.

1.8 扫描电镜(SEM)观察参考文献[12]报道的方法，取样后在4 ℃、8 000 r/min离心5 min 后得到菌体沉淀.用磷酸缓冲液清洗沉淀3次后，加入2.5%的戊二醛溶液固定3 h，再用磷酸缓冲液清洗3次，最后从低浓度乙醇到高浓度乙醇(10%～100%)梯度脱水自然干燥.待乙醇挥发完毕后，取部分干粉样品通过导电胶粘结在样品座上，通过离子溅射方式在样品表面镀金以增加导电性.镀金完毕后，使用扫描电子显微镜(JSM 6510LV, 日本JEOL会社)观察并拍照.

1.9 透射电镜(TEM)观察参考文献[12]报道的方法，将100 μL 纯化的红色纳米球悬液转移到1.5 mL离心管中，加入900 μL 无菌水混合均匀.小心取出碳支持膜型铜网，正面朝上放置于滤纸片上.取20 μL 样品，分次滴于铜网上，每次滴加前需晾干再进行下一次滴加.晾干后,将样品放入透射电子显微镜(Tencnai G20，美国FEI 公司)进行观察并拍照.

2 结果与分析

图2 茶树草螺菌在含200 mmol/L 硒酸钠LB培基中的生长曲线WT00C-Se: 在含200 mmol/L 硒酸钠LB培基中生长28 h的茶树草螺菌

2.1 茶树草螺菌WT00C-Se具有较强的硒酸盐耐受性使用含200 mmol/L 硒酸钠的LB培养基培养时，茶树草螺菌WT00C显示12 h的生长抑制期.尔后,恢复生长并在30 h达到稳定生长期(图2).当茶树草螺菌WT00C生长至28 h时, 收获、保存细菌培养物并命名为茶树草螺菌WT00C-Se.将茶树草螺菌WT00C-Se重新接种至含200 mmol/L 硒酸钠的LB培养基中培养.从图2可见，在200 mmol/L 硒酸钠条件下37℃培养，茶树草螺菌WT00C-Se的生长抑制期仅6 h.恢复生长后在24 h达到稳定生长期.与茶树草螺菌WT00C相比, 在200 mmol/L硒酸钠相同条件下生长,茶树草螺菌WT00C-Se的生长周期缩短了6 h.结果提示, 茶树草螺菌WT00C经过一轮高浓度硒酸盐培养后，其生理生化特性发生了明显的变化.与原始的茶树草螺菌WT00C相比, 茶树草螺菌WT00C-Se具有较强的硒酸盐耐受性.

图3 在含200 mmol/L 硒酸钠LB培基中生长28 h的茶树草螺菌(WT00C-Se)重新接种至0～200 mmol/L硒酸钠LB培基中培养18 h的结果

2.2 茶树草螺菌WT00C-Se拥有较强的硒酸盐还原活性茶树草螺菌WT00C-Se虽然具有较强的硒酸盐耐受性并缩短生长周期6 h.但未知它是否仍具有较强的硒酸盐还原活性.为了检测它是否具有硒酸盐还原能力，将茶树草螺菌WT00C-Se接种到分别含有0、50、75、100、150和200 mmol/L硒酸钠的LB培养基中进行摇瓶培养.由图3可知，在含有硒酸钠的LB培养基中，15 h即可见培养基颜色变红，18 h培养基颜色已转为深红，尤其在200 mmol/L硒酸钠的LB培养基中颜色最深.这个结果表明茶树草螺菌WT00C-Se依然能有效地将硒酸盐(Se6+)还原生成红色单质硒(Se0).为了进一步验证这一结果，使用含200 mmol/L硒酸钠的LB培养基培养茶树草螺菌WT00C-Se，然后在不同的生长阶段取样并在扫描电子显微镜下观察，结果见图4.由图4可知，培养6 h时, 草螺菌WT00C-Se细胞呈多细胞连接体状态，说明它们已开始分裂增殖，且其中少数细胞表面附有红色纳米硒球颗粒(图4a).培养17 h时(对数生长期),细菌细胞多呈短棒状，表面附有的红色纳米硒球颗粒的细胞增多(图4b).当培养至24 h时(稳定生长期), 绝大多数细菌细胞表面附有红色纳米硒球颗粒(图4c).由此可见, 茶树草螺菌WT00C-Se在恢复生长时就开始还原硒酸盐生成红色纳米单质硒.随着生长期的进程, 还原硒酸盐合成红色纳米单质硒的效率逐渐增强.直至稳定生长期，还原硒酸盐合成红色纳米单质硒的效率达到最大，与草螺菌WT00C[12]相似.图4d显示放大的细菌和表面附着的红色纳米硒球颗粒.这个结果再次证明茶树草螺菌WT00C-Se能有效地将六价的硒酸盐还原生成零价的红色单质硒.

图4 37 ℃、200 mmol/L硒酸钠LB培养基培养不同时间的茶树草螺菌(WT00C-Se)电子扫描电镜(SEM)观察

2.3 茶树草螺菌WT00C-Se生产红色单质硒的条件优化既然茶树草螺菌WT00C-Se能有效地将硒酸盐还原生成红色单质硒且又缩短生长周期6 h，它们应该可以替代原来的天然菌株茶树草螺菌WT00C，用于红色单质硒的生产.考虑到茶树草螺菌WT00C-Se来自含200 mmol/L 硒酸钠LB培养基培养28 h的细菌，在培养过程中它或许需要在培养基中添加一定量的硒酸盐来维护它特有的生理特性.因此，在活化阶段分别加0、10、25和75 mmol/L 硒酸钠至活化用的培养基内.活化后再转接至含150和200 mmol/L硒酸钠的LB培养基中培养，并分3个阶段取样纯化红色单质硒、称重并计算产率.考虑到不同浓度的硒酸盐影响细菌的生长速度，第一阶段让所有的细菌培养物OD600值达到1.0时再取样分析以消除不同生长带来的误差.第二阶段是让细菌培养物OD600值达到1.0时再继续培养12 h，而第三阶段则是让细菌培养物OD600值达到1.0时再继续培养24 h.实验结果(图5)表明:(1)无论是在150 mmol/L还是在200 mmol/L硒酸钠中培养，3个阶段获得的结果显示活化时未加硒酸盐其红色单质硒产率都是最低的；(2)在3个阶段中，200 mmol/L硒酸钠培养细菌时红色单质硒产率明显高于150 mmol/L硒酸钠；(3)与10、25 mmol/L 硒酸钠比较，使用75 mmol/L 硒酸钠活化细菌，红色单质硒产率最优；(4)使用75 mmol/L 硒酸钠活化细菌，转接至200 mmol/L硒酸钠培养基中培养至第二阶段，红色单质硒产率巳达(550±28)μg/mL.这个数值与相同条件下培养至第三阶段获得的产率(562±16)μg/mL比较，没有显著性差异(p>0.05).因此，茶树草螺菌WT00C-Se生产红色单质硒的优化条件设定为: 使用75 mmol/L 硒酸钠LB培养基活化茶树草螺菌WT00C-Se，然后按1∶100比例接种至含200 mmol/L 硒酸钠LB培养基中，并在37 ℃、200 r/min 培养30 h.

图5 不同条件活化的茶树草螺菌生成红色单质硒的产率比较

2.4 茶树草螺菌WT00C-Se发酵生产红色单质硒根据上述优化条件，使用5 L发酵罐发酵生产红色单质硒.发酵条件设置为：温度37 ℃、转速200 r/min、pH值为7.0、通气量为1 L/ min、LB培养基中加入终浓度为200 mmol/L硒酸钠、活化茶树草螺菌WT00C-Se时使用含75 mmol/L硒酸钠的培养基、细菌接种比例为1∶100、总体积3 L、发酵时间为30 h.刚开始发酵培养时，发酵液呈橙黄色(见图6a).发酵培养30 h后培养基颜色由橙黄色变成鲜红色(图6b)，说明发酵罐内的茶树草螺菌WT00C-Se已还原硒酸钠并生成了红色单质硒.按照前面描述的纳米硒球制备方法，获得纯净的纳米硒球.透射电子显微镜观察显示，纳米硒球呈圆球形, 直径为10～200 nm(见图6c).按照前面描述的红色单质硒制备方法，获得纯净的红色单质硒(图6d).经过3次发酵实验，获得的红色单质硒产率平均值为(560±43)μg/mL，即每升培养物可制备560 mg纯净的红色单质硒.

图6 茶树草螺菌发酵生产红色单质硒

3 讨论

在高达200 mmol/L硒酸钠条件下，茶树草螺菌WT00C虽然有长达12 h的生长抑制期.但它仍能恢复生长并在30 h达到稳定生长期.这个结果与前期研究结论[12]一致.有趣的是,将它在200 mmol/L硒酸钠条件下生长28 h后再次接入含200 mmol/L硒酸钠的培养基内培养，其生长抑制期缩短为6 h，并在24 h到达稳定生长期.与原来的茶树草螺菌WT00C相比，这个新命名的茶树草螺菌WT00C-Se在200 mmol/L硒酸钠条件下整个生长期提前了6 h.虽然有许多微生物还原硒酸盐或亚硒酸盐的报道[13-19]但它们都是在低浓度条件下进行研究，尚未见高浓度(>100 mmol/L)条件下还原硒酸盐或亚硒酸的研究报道.现在普遍接受的观点是，硒酸盐或亚硒酸进入细胞后其硒基团取代了酶或蛋白中的巯基，导致细胞内氧化应激压力增大而表现出它们的生物学毒性[20-24].茶树草螺菌WT00C-Se表现出较强的硒酸盐耐受性，说明它的生理生化性质与茶树草螺菌WT00C不同，至少拥有较强的抗氧化能力.本实验室正在进行详细的分子机理研究.

茶树草螺菌WT00C-Se具有较强的硒酸盐耐受性，并缩短生长周期6 h.使用摇瓶培养和扫描电镜观察细胞的方法，证明茶树草螺菌WT00C-Se具有较强的硒酸盐还原能力.因此，利用茶树草螺菌WT00C-Se还原硒酸盐、生产红色单质硒成为一种新的技术选择.我们通过条件优化，找到茶树草螺菌WT00C-Se还原硒酸盐生产红色单质硒的优化条件，并使用小型发酵罐成功生产出红色单质硒.依据我们设定的发酵条件，每升培养物可制备560 mg纯净的红色单质硒.这些研究结果不仅为利用微生物生产红色单质硒提供了一种全新的思路，且为今后产业化提供了强有力的技术支撑.