药食同源植物丁香各部位抗营养因子分析

刘积光，高玉梅，刘平怀，*

（1.海南大学生命科学与药学院，海南海口570228；2.海南大学化学工程与技术学院，海南海口570228）

桃金娘科（Myrtaceae）丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.），其干燥花蕾是《中国药典》2015年版中收录的中草药，该丁香为药食两用植物，是国家颁布的既是食品又是药品的101种物品名单中的一种。近年来抗营养因子逐渐受到研究者的关注，抗营养因子是植物体代谢产生的能破坏营养和阻碍其被吸收利用的物质，对动物和机体的健康及生长会产生不利影响[1]，人们把对饲料中营养物质的消化、吸收和利用产生不利影响以及使人和动物产生不良生理反应的物质，统称为抗营养因子[2]。抗营养因子种类繁多，已知抗营养因子主要有蛋白酶抑制剂、植酸、凝集素、单宁酸等[3]，其中一些抗营养因子对人体的健康也会产生负面作用[4]，这些物质在食用过量时，会影响人体对营养素的吸收能力，严重时甚至会造成中毒[5]。丁香作为药食同源植物，对于其抗营养因子的研究目前还处于缺失状态，本文主要分析丁香的花蕾、果实、枝和叶各部位的抗营养因子成分含量，为桃金娘科丁香植物资源开发利用提供基础，对丁香各部位作为食品或饲料的开发利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

花蕾（公丁香）：广西药材市场；果实（母丁香）：三亚药材市场；丁香枝、丁香叶：中国医学科学院药用植物研究所海南分所兴隆药用植物园。

植酸钠（99%）、木糖（98%）：上海麦克林生化科技有限公司；胰蛋白酶（牛胰）USP级、牛血清白蛋白（生物试剂，98%）：上海源叶生物科技有限公司；单宁酸（分析纯）：天津永大化学试剂有限公司；草酸钠（分析纯）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）（分析纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline 1X，PBS）：美国 HyClone公司。

1.1.2 设备

DHG-9071A型电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；SHA-C型水浴恒温振荡：江苏盛蓝仪器制造有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；F97 Pro荧光分光光度计：上海棱光技术有限公司；CCA-1112型冷却水循环装置：上海爱朗仪器有限公司；Master-S plus UVF型实验室超纯水机：上海和泰仪器有限公司；SY-1000E多用途恒温超声提取机：北京弘祥隆生物技术股份有限公司；STARTER 3100 pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植酸含量测定

参照GB5009.153-2016《食品国家安全标准食品中植酸的测定》进行测定，并稍加改动。准确称取丁香各部位样品5 g，加入40 mL硫酸钠-盐酸提取溶液，置摇床振荡提取4 h，提取液以8 000 r/min离心5min，上清液使用硫酸钠-盐酸定容至50 mL，抽滤后备用。样品提取液使用15%TCA溶液进行净化[6]，取植酸提取液2 mL，加入15%TCA溶液2 mL，混匀后于4℃冰箱静置2 h后，离心吸取上清液2 mL，使用1 mol/L NaOH调pH值至6.0～6.5，蒸馏水稀释至30 mL。标准曲线和样品测定按照国标进行绘制和测定。

1.2.2 胰蛋白酶抑制剂活性测定

参照GB5009.224-2016《食品国家安全标准大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定》进行测定。精确称取丁香各部位样品1 g，加入0.01 mol/LNaOH溶液50 mL，用 0.1 mol/L盐酸溶液调节pH 值至（9.5±0.1），置4℃冰箱24 h。提取液取出放置至室温（25℃），用水定容至100 mL。摇匀，静置15 min，按国标要求进行稀释。按照国标方法对胰蛋白酶使用液和样品提取液进行抑制活性的测定。

1.2.3 植物凝集素测定

样品制备：准确称取1g丁香各部位粉末，使用8mL 0.9%生理盐水提取12 h，4℃8 000 r/min离心5 min，取上清液；加入2.5 g硫酸铵，4℃冰箱放置12 h；4℃8 000 r/min离心10 min后收集沉淀，使用PBS（pH 7.40）溶解，4℃8 000 r/min离心5 min，取上清液在PBS中透析12 h，之后在去离子水中透析3 h，置于聚乙二醇中浓缩得到粗凝集素[7]。

测定方法：使用牛血清白蛋白作为标准对照品，根据考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。

血凝集试验：取离心管加适量生理盐水后，加入新鲜鸡血，摇匀，4℃8 000 r/min离心5 min，反复离心至上清液颜色透明或接近透明，去上清，收集沉淀配制1%红细胞悬液[8]。

在96孔V型微量血凝板中加入25 μL生理盐水，并依次加入25 μL凝集素样品液和25μL红细胞细胞悬液至相应孔板中。待所有孔板全部加完，轻轻摇动孔板使所加液体混匀。室温（25℃）下放置30 min后观察凝集现象。将反应板45°倾斜摆放，孔底红细胞呈现线状流动说明未被凝集，不流动说明被凝集素凝集。

1.2.4 单宁酸含量测定

参照GB/T27985-2011《饲料中单宁的测定分光光度法》进行测定。准确称取丁香各部位1.5 g，加入50 mL 50%丙酮溶液，密封置于振荡仪上振荡40 min后静置，经真空抽滤后备用。配置单宁酸溶液系列浓度 为 0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mg/L，显色后于760 nm波长处测定吸光度，根据国标方法绘制标准曲线。

1.2.5 草酸含量测定

标准曲线：取五支比色管按顺序加入2mL0.5mg/mL铁标准液，20 mL盐酸氯化钾缓冲液，1.2 mL 0.5%磺基水杨酸后并摇匀[9]。分别加入 0、0.1、0.2、0.4、0.8 mL的草酸钠标准液，用水定容至25 mL，摇匀静置显色30 min，以水作为空白，测定OD510，绘制标准曲线。

样品溶液制备：准确称取丁香各部位2.5 g，分别加入100 mL水并于75℃恒温水浴振荡锅中振荡1 h，去离子水定容至250 mL，过滤待测。

1.2.6 可溶性非淀粉多糖含量测定

标准曲线：精准移取水和 0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 mg/mL木糖标准液各2 mL于比色管中。避光环境中加入10 mL显色剂（2 g间苯三酚、10 mL无水乙醇、1 mL葡萄糖（17.5 mg/mL）、2 mL浓盐酸和110 mL冰乙酸）[10]，沸水浴加热25 min，冷却至室温（25℃），测定OD553，绘制标准曲线。

样品制备：准确称取样品2 g，加入蒸馏水20 mL，于90℃水浴锅中提取30 min，离心，沉淀加入20 mL蒸馏水重复提取2次，合并提取液浓缩至20 mL。加入60 mL pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液，加热至95℃加入α淀粉酶，55℃时加入糖化酶，恒温16 h，滤膜过滤后溶液浓缩至20 mL待测[10]。

1.3 数据处理

每个样品进行3次平行试验，结果表示为平均值±标准差的形式，试验数据采用Excel 2013和SPSS 22进行方差齐性分析最小显著性差异法（least-significant difference，LSD）检验，标准曲线使用OriginPro 9.0绘制。

2 结果与分析

2.1 抗营养因子线性关系及标准曲线

植酸标准曲线见图1。

图1 植酸标准曲线Fig.1 Standard curve of phytic acid

粗凝集素标准曲线见图2。

图2 粗凝集素标准曲线Fig.2 Standard curve of coarse lectin

单宁酸标准曲线见图3。

图3 单宁酸标准曲线Fig.3 Standard curve of tannic acid

草酸标准曲线见图4。

图4 草酸标准曲线Fig.4 Standard curve of oxalic acid

可溶性非淀粉多糖标准曲线见图5。

使用Origin9.0根据对标准曲线所得数据建立线性相关模型，均可达到0.99，说明线性拟合度较好，线性关系较强，计算结果比较可靠，所得线性公式如下：

植酸：Y=-1.122 2X+0.571 7，R2=0.999 3；粗凝集素：Y=0.152 8X+0.613 5，R2=0.989 9；单宁酸：Y=0.054 2X+0.016，R2=0.9919；草酸：Y=-4.896 6X+0.681 6，R2=0.990 3；可溶性非淀粉多糖：Y=1.140 2X+0.279 4，R2=0.991 7。

图5 可溶性非淀粉多糖标准曲线Fig.5 Soluble non-starch polysaccharide standard curve

2.2 丁香各部位抗营养因子含量结果分析

丁香各部位抗营养因子含量见表1。

表1 丁香各部位抗营养因子含量汇总Table 1 Summary of anti-nutritional factors in various parts of Eugenia caryophyllata mg/g

由表1可知，丁香各部位在单宁酸、草酸、可溶性非淀粉多糖含量方面均具有显著性差异，植酸含量果实与其他部位之间具有显著性差异。粗凝集素含量果实与其他部位具有显著性差异，果实、枝、叶之间互相具有显著性差异，而花蕾与枝、叶则没有显著性差异。

丁香叶的草酸和可溶性非淀粉多糖含量为4个部位中最高，分别为3.29 mg/g和0.83 mg/g，单宁酸含量丁香花蕾含量最高为3.58 mg/g，植酸含量以花蕾部位最高40.10 mg/g，果实部位最低为33.24 mg/g。

在粗凝集素含量方面含量最高为果实部位，为1.93 mg/g。根据微凝血试验结果发现，稀释后的凝集素提取液不具备凝血能力，4个部位均为线状流动，使用提取液原液进行试验，花蕾和枝部位红细胞呈明显线状流动，果实和枝红细胞虽有部分流动，但在孔底部分产生明显圆点。这表明果实和叶的粗凝集素在随着含量升高的情况下会发生微弱的凝血现象。

2.3 胰蛋白酶抑制活性

丁香各部位胰蛋白酶抑制剂活性（typsin inhibitor activity，TIA）见表 2。

胰蛋白酶抑制剂作为一种抗营养因子[11]，能抑制胰蛋白酶的水解作用[12]，其与胰蛋白酶的必需基团发生不可逆反应，形成稳定的混合物，从而抑制胰蛋白酶与底物的结合[13]，使酶活性降低，进而导致机体对蛋白质的吸收受限，影响机体的生长发育与代谢[14]。丁香果实的TIA与其他3个部位之间均具有显著性差异，而花蕾、枝、叶之间差异不显著。试验结果表明丁香各部位胰蛋白酶抑制剂活性表现相近，果实的TIA为44.20 mg/g，与其他3个部位表现出显著性差异性，其他3个部位均为41 mg/g左右。

表2 丁香各部位胰蛋白酶抑制剂活性Table 2 Inhibitory activity of trypsin inhibitors in various parts of Eugenia caryophyllata

3 讨论

桃金娘科丁香作为药食同源植物，兼具药用和食用价值，在医药、保健品、食品、化妆品、饲料等方面的应用具有较大的潜力，而目前丁香集中在花蕾部位的药用价值开发，其食用价值开发空间巨大，在食品和饲料的应用潜力也是巨大的[15]。而抗营养因子是食品和饲料开发需要注意的重要因素，抗营养因子是植物体代谢产生的能破环营养和阻碍其被吸收利用的物质，对动物和机体的健康及生长会产生不利影响[16]。抗营养因子种类繁多，已知的主要有植酸、胰蛋白酶抑制剂、凝集素、单宁等，其中有部分对人体的健康有负面作用，会影响人体对营养素的吸收能力，严重时甚至会造成中毒[17]。

文章通过对丁香各个部位的主要抗营养因子的含量测定，丁香各部位可溶性非淀粉多糖含量远低于小麦、玉米等谷物[10]。草酸含量也远低于菠菜[鲜样（1 815±33.2）mg/100 g][18]的含量，一旦人体摄入的草酸过量，草酸会与体内的Ca2+和Zn2+结合形成难溶的草酸钙和草酸锌沉淀，将导致人体缺乏钙元素和锌元素并引发结石等疾病[19-20]。丁香果实粗凝集素含量为1.93 mg/g，与大豆中凝集素含量相当[21]，但叶的粗凝集素含量为0.97 mg/g为4个部位最低，可能丁香的粗凝集素含量与凝血能力并不具备线性关系。丁香各部位胰蛋白酶抑制活性最高的部位为果实，低于大豆的胰蛋白酶抑制活性[22]。综上所述，且丁香花蕾本身就是既是食品又是药品，丁香各部位抗营养因子含量通过与花蕾部位和其他常见食品之间的比较，其均在合理健康安全的范围内，这表明丁香各部位在抗营养因子方面均适合作为食品或饲料的开发。