RP-HPLC法分析测定人参、西洋参、三七中的皂苷类化合物

王晶，张勇，毕萌菲，李福森，刘春明

（长春师范大学中心实验室，吉林长春130032）

五加科人参属中重要的3种植物人参、西洋参、三 七均为名贵中药材，现代药物化学研究表明，三者中主要的有效成分均为皂苷类化合物，迄今为止，从人参中分离得到近百种皂苷单体化合物[1-3]，从西洋参和三七中也分离得到了数十种人参皂苷[4-6]。3种中药有效成分中含有多个相同的单体皂苷类化合物，但也有其特征的皂苷成分，例如拟人参皂苷F11为西洋参特征性成分，三七皂苷R1为三七特征成分[7]。现代药理作用研究表明，人参皂苷类化合物具有广泛的药理活性，如延缓衰老、提高免疫力、抗肿瘤、益智、抗氧化、抗高血压、抗高血糖以及防治阿尔兹海默症等作用[8-10]，广泛应用于食品、药品、保健品及化妆品等领域。

人参于2012年被审批为新资源食品后，在食品工业中发展迅速，近年来出现大量与人参相关的各种食品；而西洋参因为被广泛认为“温补”的特性，在保健品市场中常有销售；而被称为“铜皮铁骨”的三七近年来更是备受瞩目中药药效研究发现有效成分决定了其药理活性，而人参、西洋参和三七作为同科同属的植物，较多的成分是比较相似的，而作为其中最重要组分的皂苷类成分，诸多的学者进行大量的研究。本研究选购市售人参根部切片、西洋参根部切片和三七根部药材，以其中主要皂苷类化合物为研究对象，考察3种不同的提取方法（回流、超声辅助、温浸）对皂苷类化合物的提取效果，应用高效液相色谱（high perfor mance liquid chromatography，HPLC）分析3种药材中8种主要单体皂苷含量，考察市售人参、西洋参和三七药材中主要成分（皂苷类化合物）在不同药材中的分布情况以及主要皂苷含量差异。

1 试验部分

1.1 药品与仪器

1.1.1 试剂与材料

液相色谱所用试剂（乙腈为色谱纯）：加拿大Caledon LaboratoriesL公司；超纯水：长春师范大学中心实验室自制；0.45 μm滤膜：美国Agilent公司；乙醇、甲醇（均为分析纯）：北京精细化学品有限公司。人参切片、西洋参切片、三七根部药材：同仁堂大药房；人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd、三七皂苷 R1对照品：中国药品生物制品检定所。

1.1.2 仪器设备

高效液相色谱为Agilent 1100（配备四元梯度泵、自动在线脱气机）、Agilent1200系列柱温箱，色谱柱型号为 Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用 DAD检测器：美国安捷伦有限公司；Advantage A10密理博超纯水净化系统：法国密理博科技有限公司；Hei-VAP旋转蒸发仪：中国上海EYELA公司；BS-124S电子天平：德国赛多利斯有限公司；S180H超声清洗器：德国Elma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

将人参、西洋参、三七药材粉碎，过80目筛，采用不同提取方法进行样品制备。

超声辅助提取法：分别精密称取人参粉末1.0008g、西洋参粉末1.000 7 g和三七粉末1.000 4 g置于100 mL具塞锥形瓶中，用30 mL 95%乙醇浸泡30 min，超声辅助提取30 min，重复上述提取过程3次。将乙醇提取液合并后过滤，减压回收溶剂至干，色谱甲醇溶解残渣，定容至10 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜，得到人参、西洋参、三七样品超声辅助提取物（主要为皂苷类化合物），4℃保存，待用。

分别精密称取人参粉末1.000 6 g、西洋参粉末1.000 8 g、三七粉末1.000 9 g置于100 mL具塞锥形瓶中，90 mL 95%乙醇浸泡 30 min，70℃回流提取120 min。将乙醇提取液过滤，减压回收溶剂至干，色谱甲醇溶解残渣，定容至10 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜，得到人参、西洋参、三七回流提取物溶液，4℃保存，待用。

分别精密称取人参粉末1.000 8 g、西洋参粉末1.000 3 g、三七粉末1.000 1 g，30 mL 95%乙醇浸泡30 min后60℃水浴温浸提取60 min，提取3次。合并乙醇提取液，过滤，滤液减压回收至干，色谱甲醇溶解残渣，定容至10 mL容量瓶中，过0.45 μm滤膜，得到人参、西洋参、三七样品温浸提取物，4℃保存，待用。

1.2.2 皂苷标准溶液配制

分别精密称取三七皂苷R1标准品、人参皂苷标准品 Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rd 各 1.00 mg，色谱纯甲醇溶解，得到浓度为约1 000 μg/mL的储备液，-20℃的冰箱保存，待用。

1.3 HPLC分析条件

高效液相色谱分析条件如下：流动相组成为乙腈（A），0.05%的磷酸水溶液（B），流动相梯度：0～2 min，75%B；2 min～50 min，75%～50%B，流速为 0.5 mL/min。样品总运行时间为50 min，柱温选择35℃，样品进样量为 10 μL。

2 结果分析与讨论

2.1 标准曲线的绘制

由于不同皂苷单体在相同的浓度下出峰的情况有所差异，因此在配制皂苷混合标准品样品时，皂苷单体的浓度各不相同，根据前期试验结果，分别移取人参皂苷 Rb10.20 mL，三七皂苷 R1、人参皂苷 Re、Rg1、Rb2、Rd各0.10 mL，人参皂苷Rf和Rc各0.05 mL，配制皂苷混合标准品溶液。应用HPLC对皂苷标准品混合溶液进行分析，其中人参皂苷Re+Rg1合并出峰，其他各皂苷均得到较好的分离。以各皂苷的色谱峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标绘制标准曲线，得到不同皂苷的回归方程，分别为人参皂苷Rd方程为y=556.6x+5.2169，回归系数r为1；人参皂苷Rc方程为y=460.47x+25.155，回归系数r为0.999 9；三七皂苷R1标准曲线方程为y=314.57x+134.66，回归系数r为0.9998；人参皂苷Rb1方程为y=479.74x+25.155，回归系数r为0.999 8；人参皂苷Rb2方程为y=592.31x-6.623 3，回归系数r为0.999 8；人参皂苷Re+Rg1（合并出峰）方程为y=457.08x+303.81，回归系数r为0.993 9；人参皂苷Rf方程为y=313.62x+7.227 2，回归系数r为0.999 4。

2.2 HPLC分析的方法学考察

2.2.1 精密度

按1.3HPLC分析条件，对皂苷混合标准品重复测定5次，分别记录8种皂苷（Rg1和Re合并出峰）色谱峰峰面积和保留时间，计算二者的标准偏差，结果表明7个色谱峰峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值分别为0.21%、0.40%、0.25%、0.24%、0.28%、0.36%、0.29%和0.34%，而保留时间RSD值在0.11%～0.37%范围之内，表明仪器方法的精密度较好。

2.2.2 稳定性

按1.3中HPLC分析条件检测人参超声辅助提取物（人参提取物中含有皂苷种类较多，具有代表性），分别于制备样品后的 0、2、6、10、16、24 h 进行 HPLC 分析。结果表明各主要皂苷的色谱峰面积的RSD值均小于1.34%，样品稳定性在24 h内较好。

2.2.3 重现性

取人参药材粉末按1.2.1超声辅助提取方制备5份供试液，应用HPLC进行分析。结果表明，各主要皂苷峰面积的RSD均小于1.21%，仪器方法重现性较好。

2.2.4 回收率

取人参药材粉末按1.2.1超声辅助提取方制备3份供试液，分别加入适量的7种人参皂苷（人参中不含有三七皂苷R1，因此没有在人参提取物中添加三七皂苷R1），应用HPLC检测加样回收率。结果表明，主要皂苷的平均加样回收率分别为100.22%、98.35%、97.20%、99.39%、100.27%和98.28%，RSD值在0.19%～0.45%范围内，说明人参皂苷加标回收率良好。

三七、西洋参、人参超声辅助提取物及皂苷标准品HPLC指纹图见图1，皂苷结构见图2，图2中不同皂苷的结构式中R1、R2、R3代表的基团见表1。

图1 人参、西洋参、三七提取物及皂苷标准品HPLC图（λ=203 nm）Fig.1 HPLC of ginseng，Panax quinquefolium，Panax notoginseng extracts and mixture standard saponins（λ=203 nm）

图2 主要皂苷结构图Fig.2 Structure of main saponins

2.3 不同提取方法的比较

人参皂苷的提取方法较多[11-14]，本文以五加科人参属具有代表性的3种植物人参、西洋参和三七为研究对象，主要采用超声辅助、回流和温浸法对其中的皂苷类化合物进行提取，通过反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）方法分析3种药材中的主要单体皂苷的含量，结果如表2所示。

从表2数据可知，不同方法对3种药材中所提取的主要皂苷种类基本没有影响，但对其含量影响较大。结果表明，3种药材的超声辅助提取物中主要皂苷的含量较高，回流提取物次之，温浸提取物皂苷含量相对较低。相对于回流提取，超声辅助提取物中杂质较少，更便于过滤以及后续的分析检测，且超声辅助提取效率较高、方法便捷。

表2 不同提取物中主要皂苷的含量（n=3）Table 2 Contents of main saponins in different extracts（n=3）mg/g

2.4 3种药材中的主要皂苷含量比较

3种药材超声辅助提取物中主要皂苷情况见图3。

图3 3种药材超声辅助提取物中主要皂苷情况Fig.3 The main saponins of the different ultrasonic extracts

从表2和图3的数据可以看出，在3种五加科人参属代表药材中，人参提取物中含有的主要皂苷种类较多，但对于相同质量的人参、西洋参和三七药材来说，人参提取物中三者共有的主要皂苷含量相对较低；西洋参提取物中未检测到人参皂苷Rf，但其他人参皂苷含量均高于人参提取物，其中，Re、Rg1、Rb1和Rd含量远高于同质量的人参提取物；三七皂苷R1为三七的特有成分，在三七提取物中含量较高；三七提取物中未检测到人参皂苷Rf、Rc和Rb2，其他主要人参皂苷单体的含量均远高于同质量的人参和西洋参提取物。根据文献报导，在人参的各部位中，参须中皂苷的含量相对较高，而在主根中其多分布于周皮与皮层中，相对的人参肉质髓心的皂苷含量较低[15]，由于所购买的人参切片中没有参须部位，可能导致了其人参皂苷含量较低。有研究对人参、西洋参和三七药材中总皂苷含量进行比较，发现三七提取物中总皂苷含量较高，其次是西洋参提取物[16]。由于所购买的药材为人参、西洋参的切片和三七的根部，因此，三七中主要皂苷的含量较高，而西洋参提取物中皂苷含量次之，人参切片提取物中主要皂苷含量相对较低，但符合药典规定标准，2015版药典规定人参中Rg1和Re的总量不低于0.3%，Rb1的含量不低于0.2%。

3 结论

以五加科人参属代表药材人参、西洋参和三七中皂苷类化合物对研究对象，采用超声辅助、回流和温浸法进行提取，应用RP-HPLC方法对不同提取物中8种主要皂苷（其中Rg1和Re合并出峰）进行定量分析。结果表明，对比三种不同的提取方法，均为超声辅助法对3种药材中皂苷类化合物提取效果较好，且超声辅助提取效率较高，提取物中杂质较少。对比3种药材中主要皂苷的分布，人参中皂苷种类较多，只有三七皂苷R1（三七特有成分）未检测到，而西洋参提取物中未检测到人参皂苷Rf和三七皂苷R1，三七提取物中未检测到人参皂苷Rf、Rc和Rb2；对比不同提取物中主要皂苷含量，在3种药材的共有皂苷中，三七根部药材中主要皂苷含量较高，西洋参次之，人参切片药材中的皂苷含量相对较低，但符合药典规定。