山葵酸奶工艺及挥发性风味物质研究

罗倩，田计均，唐媛，余海萍，李瑞瑾，孙雁霞，，*

（1.民办四川天一学院，四川绵竹618200；2.成都大学药学与生物工程学院，四川成都610106；3.成都大学教务处，四川成都610106）

山葵（Wasabia japonica Matsum）是十字花科多年生宿根性喜阴草本植物，皮绿色，髓部偏白，肉质坚硬，磨碎后具有挥发性芒香辣味[1]。山葵含有丰富的氨基酸、维生素和人体所需的多种微量元素，其组织内存在芥子苷，在水解酶的作用下发生酶促水解，释放出极易挥发的异硫氰酸酯，该物质具有杀菌抗癌、抗骨质疏松、抗肥胖、抗氧化、抗病毒、增强免疫力等多种保健作用[2-4]。目前以山葵为原料的加工产品主要有山葵叶茶[5]、山葵叶柄调味菜[6]、山葵抑菌口香糖[7]、山葵油米辣[8]、山葵调味酱[9]等，而将山葵应用于酸奶加工中的研究较少，其许多潜在价值尚未开发。

本试验以山葵为原料，利用其中的特殊成分，研制出一种集山葵和酸奶的保健功能于一体且风味独特的新型酸奶。以感官评价为指标，采用响应面法对山葵粉添加量、发酵剂接种量、白砂糖添加量、发酵时间进行优化，为山葵的开发提供新的思路，同时开辟乳品业的新市场。以普通酸奶为对照，采用顶空固相微萃取技术（high space solid phase micro-extraction，HS-SPME）与气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术对两种酸奶挥发性风味物质进行测定，以分析山葵酸奶风味特点与优势，为其市场推广提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜山葵：广元市玺府农业开发有限公司；纯牛奶：市售；低脂果胶、白砂糖：市售；直投式酸奶发酵剂：保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：市售；开米蔬果清洗剂：天津德利丰商贸有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器：上海沪粤明科学仪器有限公司；LYD500W-T型均质机：上海岚誉智能化科技有限公司；DHP-9082恒温培养箱：天津市顺诺仪器科技有限公司；TP302N电子天平：上海菁海仪器有限公司；Z15092431优普系列超纯水器：四川优普超纯科技有限公司；KDN-102C定氮仪：上海纤检仪器有限公司；ZS46-350苏泊尔榨汁机：浙江苏泊尔股份有限公司；7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪、50/30 um DVB/CAR/PDMS固相微萃取头：安捷伦科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 山葵酸奶制备工艺流程

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 山葵粉的制备

选取无发黄的新鲜山葵，用流水冲洗干净后，浸入0.2%～0.8%的开米蔬果清洗剂溶液浸泡5 min～15 min，再用无菌水冲洗干净，用滤纸吸干山葵表面的水份后，在真空状态下进行冷冻干燥，并用液氮粉碎机进行冷冻粉碎，将冷冻粉碎后得到的粉末过200目药典筛，即得到山葵极细粉。

1.3.2.2 发酵剂的制备

在无菌室内取1 g直投式发酵剂干冻粉（保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌为1∶1，质量比）加入500 mL纯牛奶中，混匀后，置于在42℃恒温培养箱中发酵培养至凝固，然后贮存于4℃冰箱冷藏，制得黏稠的原味酸奶，作为试验用发酵剂[10]。

1.3.2.3 配料均质

将白砂糖和稳定剂混合均匀按试验设计比例加入到已预热至80℃～85℃牛奶中，立即快速搅拌使稳定剂溶解，避免稳定剂发生聚集，当混合物溶解完全后，利用均质机在20 MPa下均质10 min[11]。

1.3.2.4 杀菌冷却

在95℃下杀菌5 min后，需将灭菌奶冷却至40℃～45℃，并按试验设计比例加入山葵粉混合均匀。在添加山葵粉时，温度过高会使山葵水解酶失活，导致无法生成异硫氰酸酯，并加快已生成异硫氰酸酯的挥发[12]。

1.3.2.5 接种发酵

按试验设计比例接种活化后菌种，置于42℃恒温培养箱中发酵，发酵4 h后，每隔10 min检测一次酸度，直到酸度达到75°T时终止发酵。

1.3.2.6 冷却后熟

发酵完成后，将酸奶迅速冷却至10℃以下，并置于4℃下冷藏24 h，产品风味进一步形成，得到山葵酸奶成品[13]。

1.3.3 单因素试验设计

1.3.3.1 山葵粉添加量的影响

在发酵剂接种量3.0%、白砂糖添加量7%、发酵时间6 h的条件下，考察山葵粉添加量（1%、3%、5%、7%、9%）对酸奶感官评分的影响。

1.3.3.2 白砂糖添加量的影响

在山葵粉添加量5%、发酵剂接种量3.0%、发酵时间6 h的条件下，考察白砂糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）对酸奶感官评分的影响。

1.3.3.3 发酵剂接种量的影响

在山葵粉添加量5%、白砂糖添加量7%、发酵时间6 h的条件下，考察发酵剂接种量（1%、2%、3%、4%、5%）对酸奶感官评分的影响。

1.3.3.4 发酵时间的影响

在山葵粉添加量5%、发酵剂接种量3.0%、白砂糖添加量 7%的条件下，考察发酵时间（4、5、6、7、8 h）对酸奶感官评分的影响。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验研究结果的基础上，确定试验因素，采用Dsign Expert 8.0.6软件，根据Box-Behnken设计原理，选择山葵粉添加量（A）、发酵剂接种量（B）、白砂糖添加量（C）、发酵时间（D）4个因素为自变量，每个自变量的高低水平分别以-1，0，1进行编码，其中0水平为单因素试验得出的最佳水平。以山葵酸奶的感官评分为响应值进行响应面优化试验，确定山葵酸奶制备的最佳工艺。具体响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 指标测定

1.3.5.1 理化指标检测

酸度检测：采用滴定法测定山葵酸奶的酸度，参考GB 5009.239-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》。

蛋白质检测：采用凯氏定氮的方法测定产品蛋白质，参考GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。

非脂乳固体的测定：参考GB 5413.39-2010《食品安全国家标准乳和乳制品中非脂乳固体的测定》。

1.3.5.2 微生物指标检测

按照GB 4789.18-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验》要求测定酸奶中大肠菌群、致病菌数和乳酸菌数。

1.3.5.3 感官评定

根据GB 19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》感官要求进行感官评价。由20名专业人员组成感官评定小组，参照表2的评定标准，分别对山葵酸奶的组织状态（30分）、滋味（35分）、风味（20分）和乳清析出（15分）进行评分，取其平均值作为山葵酸奶感官评定最后得分。

表2 山葵酸奶感官评定标准Table 2 Sensory evaluation standard of horseradish yogurt

1.3.6 挥发性风味物质的测定

1.3.6.1 样品前处理

分别秤取山葵酸奶和普通酸奶（未添加山葵粉）样品5 g置于25 mL萃取品瓶，同时加入2 g NaCl及5 mL超纯水，旋紧萃取瓶，充分混匀，加热到45℃，盐析30 min待检。推动固相微萃取装置手柄将老化好的萃取头插萃取瓶中，距离样品页面1 cm处左右进行顶空吸附萃取，盐析萃取40 min左右。取出完成吸附萃取的萃取头，迅速插入气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪器进样口，推出纤维头，于250℃下解析5 min。进行GC-MS分析。

1.3.6.2 GC-MS条件

实验组患者急救和疼痛缓解时间均少于对照组；研究组患者的临床护理满意度为97.5%，显著高于对照组的70%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、表2。

1）色谱条件

色谱柱：DB-WAX石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：常温升至 40 ℃，保持 2.5 min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min升至240℃，保持5 min；进样口温度为250℃；传输线230℃，全扫描模式；载气为氦气，流速1.0 mL/min；不分流进样。

2）质谱条件

EI电力源，70 eV电子能量；离子源温度为250℃，质量扫描范围为35 amu～400 amu；发射电流100 μA，检测电压1.4 kV。

1.3.6.3 定性定量方法

将试验数据图谱与NIST2011标准色谱数据库进行自动检索匹配，并参考相关文献，对试验结果进行确认。根据样品保留时间进行定性，并按面积归一法计算该物质的相对百分含量。

1.3.7 数据处理

采用 office Excel 2010和 origin 9.0、Design Expert 8.0.6进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 山葵粉添加量对酸奶感官品质的影响

山葵粉作为山葵酸奶试验的主要原料，对山葵酸奶的滋味起决定性的作用，根据添加量的多少，山葵风味及其独特的辛辣味所占比例将产生差异。添加量过少，则山葵风味及其独特的辛辣味不足，甜味及酸味相对偏重；添加量过大，则山葵风味及辛辣味偏大，甜味及酸味相对不明显。山葵粉添加量对山葵酸奶感官评分的影响见图1。

由图1可知当山葵粉添加量为时5%，感官评分最高，得到的产品风味醇厚，辛辣味、甜味及酸味适中，滋味协调，基质为翠绿色。因此，山葵粉的适宜添加量选为5%。

图1 山葵粉添加量对山葵酸奶感官评分的影响Fig.1 Influence of horseradish powder addition on sensory score of horseradish yogurt

2.1.2 发酵剂接种量对酸奶感官品质的影响

发酵剂接种量对酸奶感官评分的影响见图2。

图2 发酵剂接种量对酸奶感官评分的影响Fig.2 Influence of the amount of starter inoculation on the sensory quality of yogurt

由图2可知，感官评分开始时随着发酵剂的增加而增加，当发酵剂接种量为3%时，感官评分最高，随后感官评分随着发酵剂的增加而降低。其原因可能是接种量过大则产酸过快，易造成凝乳中蛋白质脱水收缩现象，使乳清析出较多，导致酸奶感官品质降低。因此，发酵剂适宜接种量选为3%。

2.1.3 白砂糖添加量对酸奶感官品质的影响

白砂糖添加量对山葵酸奶感官评分的影响见图3。

由图3可知，酸奶感官品质随白砂糖添加量的递增先增加后降低，在白砂糖添加量为7%时评分最高，得到的产品酸甜协调，辛辣适宜。当添加量低于7%时，酸奶以酸味及辛辣味为主，甜味不明显，感官品质较低；当添加量高于7%时，虽然酸味和辛辣味在一定程度上有所掩盖，但人工矫味痕迹明显，甜味偏重，感官品质下降。因此选择风味最协调的7%白砂糖添加量。

2.1.4 发酵时间对酸奶感官品质的影响

发酵时间对酸奶感官评分的影响见图4。

图3 白砂糖添加量对山葵酸奶感官评分的影响Fig.3 Influence of sugar content on sensory score of horserpish yogurt

图4 发酵时间对酸奶感官评分的影响Fig.4 Influence of fermentation time on sensory score of yogurt

随着发酵时间的增加，酸奶基质越稳定，酸味越浓厚。发酵时间过少，则酸奶基质不稳定，有不同程度的乳清析出现象，并且酸味不足；发酵时间过长，酸味偏重，而凝固的酸奶基质区别不大，因此根据评分选择最佳发酵时间为6 h。由图4可知，发酵时间为6 h时，感官评分最高，因此选择最佳发酵时间为6 h。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验结果

根据单因素试验结果选择山葵粉添加量、发酵剂接种量、白砂糖添加量、发酵时间4个因素为自变量，以山葵酸奶的感官评分结果为响应值，设计了四因素三水平29个点的响应面分析试验，试验结果如表3所示。

表3 响应面试验结果Table 3 Experimental design and results forresponse surface analysis

续表3 响应面试验结果Continue table 3 Experimental design and results forresponse surface analysis

2.2.2 回归方程拟合及方差分析

利用Dsign Expert 8.0.6软件进行回归分析，对表3数据进行回归拟合得到回归方程Y=94.40-1.59A+3.03B-1.03C+1.99D-1.10AB+1.82AC+2.15AD-2.05BC-1.06BD+0.53CD-5.13A2-4.99B2-7.07C2-3.03D2

对表3回归模型进行方差分析，结果见表4。

表4 响应面试验回归方程方差分析结果Table 4 Result of variance analysis of regression equation of response surface test

续表4 响应面试验回归方程方差分析结果Continue table 4 Result of variance analysis of regression equation of response surface test

由表4可知，感官评分模型显著（p＜0.05），失拟项不显著（p＞0.05），说明方程拟合充分，回归方程的相关系数R2=0.986 2，R2Adj=0.972 4表明拟合度良好，说明试验数据可以较好反应和感官评分间的关系。由p值可知，一次项中山葵粉液添加量（A）、发酵剂接种量（B）、发酵时间（D）对感官评分有极显著影响，白砂糖添加量（C）对感官评分有显著影响。二次项 A2、B2、C2、D2对感官评分有极显著影响。各因素间的交互作用AC、AD、BC、BD对感官评分有显著影响。由主要因素A、B、C、D的各F值可知，各因素对山葵酸奶的感官品质影响的顺序为：发酵剂接种量（B）＞发酵时间（D）＞山葵粉液添加量（A）＞白砂糖添加量（C）。

2.2.3 响应面图分析

通过Design-Expert分析得到山葵酸奶响应面分析图，图5为交互因素对响应面值的响应曲面及等高线图。

图5 各因素交互影响感官评分的等高线图和响应曲面图Fig.5 Contour plot and response surface plot of sensory score were affected by various factors

由图5可知，山葵酸奶感官评分随着新鲜山葵粉添加量、发酵剂接种量、白砂糖添加量、发酵时间的增加均呈现先增加后减少的关系。经软件分析得到山葵酸奶的最佳工艺条件为：山葵粉添加量为4.82%，发酵剂接种量为3.33%，白砂糖添加量为6.86%，发酵时间为6.17 h。

2.2.4 验证试验

利用回归模型预测山葵酸奶的最佳工艺条件为：山葵粉添加量为4.82%，发酵剂接种量为3.33%，白砂糖添加量为6.86%，发酵时间为6.17 h。考虑到实际情况，将最佳工艺参数调整为：山葵粉添加量为4.8%，发酵剂接种量为3.3%，白砂糖添加量为6.9%，发酵时间为6.2 h，感官评分达95.27。为验证模型的准确性，按最佳优化工艺条件进行3次重复验证试验，所得酸奶产品呈现淡绿色，表面光滑，有微量乳清析出，凝乳结实，酸甜可口，有山葵特殊的辛辣味及山葵香气，综合评分94.78分。与模型预测值接近，说明响应面优化的山葵酸奶发酵工艺是可行的。

2.3 山葵酸奶质量评价结果

2.3.1 理化指标检测结果

产品理化检测结果见表5。

表5 理化指标检测结果Table 5 Physical and chemical index test results

由表5可知，其蛋白质含量2.56 g/100 g，酸度85.0°T，脂肪 3.03 g/100 g，非脂乳固体 8.29 g/100 g。由此可见山葵酸奶理化指标均符合国标的要求，产品品质得到了保证。

2.3.2 微生物检测结果

微生物检测结果见表6。

表6 微生物指标检测结果Table 6 Microbial index test results CFU/mL

由表6可知，山葵酸奶乳酸菌数为8.03×107CFU/mL，大肠杆菌、致病菌未检出，山葵酸奶微生物指标符合国标要求。

2.4 挥发性风味物质的测定

2.4.1 总离子色谱图

采用SPME富集酸奶中挥发性风味物质，并利用GC-MS联用仪进行分离鉴定。得到的山葵酸奶样品总离子流图见图6，普通酸奶样品总离子流图见图7。

2.4.2 风味物质含量及种类分析

经过GC-MS的检测分析，利用NIST数据库自动匹配，并参考相关文献，在山葵酸奶、普通酸奶中共检测的物质如表7所示。

从表7可知，山葵酸奶和普通酸奶的挥发性风味物质主要包括醛类、酯类、醇类、酮类、酸类、烃类物质等6类。两种酸奶风味物质的种类无明显差别，但物质间含量有差异，各类风味物质呈味阈值差距大，使得两种酸奶有各自独特风味特征。

图6 山葵酸奶总离子流图Fig.6 Total ion flow chart of horseradish yogurt

图7 普通酸奶总离子流图Fig.7 Total ion flow chart of general yogurt

表7 山葵酸奶、普通酸奶挥发性风味物质种类及相对含量Table 7 Kinds and relative contents of volatile flavor substances in horseradish yogurt and ordinary yogurt

山葵酸奶共检测到34种挥发性风味物质，包括醛类7种（17.96%）、酯类9（19.6%）、醇类2种（5.6%）、酮类3种（24.59%）、酸类7（22.72%）、烃类5（6.35%），其他1种（2.35%）；普通酸奶共检测到29种挥发性风味物质，包括醛类7种（11.06%）、酯类7（8.83%）、醇类 2种（5.41%）、酮类1种（19.73%）、酸类5种（38.31%）、烃类6（9.8%），其他1种（3.12%）。

醛类物质是酸奶典型的重要风味成分之一，产生各种氧化风味，其风味阈值一般较低，对风味作用较大[14]。山葵酸奶较普通酸奶醛类物质高，分别为17.96%、11.06%。主要是山葵酸奶中壬醛和反-2-十二烯醛的相对百分含量高于普通酸奶，可赋予酸奶玫瑰、柑橘等香气。

酯类化合物的产生主要是由于脂肪酸水解和微生物代谢，酯类化合物的风味阈值低，尽管相对百分含量低，但对酸奶的风味作用贡献高[15]。山葵酸奶较普通酸奶酯类物质高，分别为19.6%、8.83%。山葵酸奶和普通酸奶中共同检测到的酯类物质中对风味贡献较大的是丁位十二内酯、丁位癸内酯。丁位十二内酯具有浓甜的桃子、香草味、奶油味；丁位癸内酯具有桃子、乳脂香气。山葵酸奶含特有的3-丁烯基异硫氰酸酯、异硫氰酸稀丙酯、甲基异硫氰酸酯，可赋予酸奶特殊的辛香味。

醇类物质风味阈值较高，通常对对食品整体风味的影响不大[16]。两种酸奶醇类物质含量差别不大，分别为5.60%、5.41%，含量较低，对风味贡献不大。

酮类物质主要由不饱和脂肪酸的氧化、热降解和氨基酸降解产生，对风味贡献较大[17]。山葵酸奶较普通酸奶酮类物质高，分别为24.59%、19.73%，共有成分甲基庚基甲酮赋予酸奶果香、甜香、蜡香、皂香、青香及椰子、奶油的气味。山葵酸奶特有成分甲基壬基甲酮、1，8-二氮杂环四癸烷-2，9-二酮可赋予酸奶出水果味、新鲜味。

酸类物质是酸奶的主要风味物质，对酸奶的滋味及气味起到重要作用[18]。山葵酸奶和普通酸奶酸类物质含量差异较大，分别为22.72%、38.31%。造成两种酸奶在酸类物质的差异可能是山葵中的异硫氰酸酯影响了乳酸菌的生长，从而造成山葵酸奶中酸类物质含量低于普通酸奶。酸奶两种酸奶共同检出的酸类物质分别是辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸，形成了酸奶的酸爽口感。其中辛酸呈水果香气；壬酸呈淡的脂肪和椰子香气；葵酸是脱脂乳酸奶中主要的呈味酸类，增加奶香；月桂酸在感官上表现为爽口微甜；肉豆蔻酸具有辛香味。山葵酸奶特有的己酸、棕榈酸可赋予酸奶特殊的香味。酸奶中过高的酸奶物质会造成刺激性气味，对比普通酸奶，山葵酸奶减少了尖酸口感，风味更佳柔和。烃类的风味阈值较高，几乎没有香气，对酸奶的风味影响不大[19]。山葵酸奶烃类物质较普通酸奶低，分别为6.35%、9.80%，主要为烷烃类化合物。

3 结论

经单因素试验及响应面优化试验，确定山葵酸奶最佳生产工艺条件为：山葵粉添加量为4.8%，发酵剂接种量为3.3%，白砂糖添加量为6.9%，发酵时间为6.2 h，综合感官评分94.78分，与模型预测值95.27接近。采用SPME-GC-MS技术测定山葵酸奶和普通酸奶风味物质表明，山葵酸奶醛类、酯类、醇类、酮类物质含量高于普通酸奶，而酸类、烃类物质低于普通酸奶，山葵酸奶醛类、酯类、醇类、酮类、酸类、烃类分布更加合理，酸味降低风味更加柔和，形成了山葵酸奶特有的辛香风味。