山药多糖提取工艺的响应面法优化及其功能活性分析

段伟萍，李新蕊，司明东，李可昕，温子帅，马东来，*

（1.河北中医学院药学院，河北石家庄050200；2.南京中医药大学药学院，江苏南京210023）

山药为薯蓣科植物薯蓣（Dioscoreaopposita Thunb.）的块茎，为多年生缠绕草木植物，属药食兼用材料[1-2]。山药富含蛋白质、粗纤维、淀粉、多糖、尿囊素、皂苷等多种化学成分，现代药理研究结果表明其具有降血糖、抗氧化、抗衰老、调节免疫等作用[3-5]。山药中的有效成分之一是多糖，研究表明，山药多糖具有较强的自由基清除作用、抗氧化作用，这与其组分、结构密切相关[6]，如朱娇娇等[7]报道了山药多糖提取物能够显著抑制α-葡萄糖苷酶活性，可达到60%。山药多糖常用提取方法有回流提取法、超声提取法和微波提取法等，如李培[8]报道了酶法提取山药多糖，并探讨了山药多糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用条件：山药多糖浓度40 mg/mL，温度 40℃，时间 10 min，pH 7.2 时，山药多糖对α-葡萄糖苷酶具有较强抑制作用，抑制常数Ki为65.78 mg/mL。

本试验以山药为原料，利用Box-Behnken设计-响应面法优化山药多糖的超声辅助提取工艺，再经过醇沉、Sevag法脱蛋白和透析等步骤，得到山药多糖。考察不同产地山药多糖对α-葡萄糖苷酶酶活的抑制和体外抗氧化活性，以期为山药的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器设备

1.1.1 材料

祁山药、广西山药、河南怀山药、安国怀山药样品：河北安国东方中药材市场，经河北中医学院郑玉光教授鉴定均为薯蓣科植物薯蓣（Dioscorea opposita Thunb.）的块茎。

1.1.2 试剂

羟自由基试剂盒、超氧阴离子试剂盒：南京建成生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）试剂、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，PNPG）、阿卡波糖：美国Sigma公司；甲醇、乙酸等试剂均为分析纯：天津市永大化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器设备

岛津UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；ME204E型十万分之一电子天平：德国SARTORIUS公司；KQ-300DE型数控超声波提取器：昆山市超声仪器有限公司；索氏提取器：北京欣维尔玻璃仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山药纯多糖的制备

参照文献方法[9-10]，精密称取山药细粉5.0 g，采用索氏提取器脱脂处理后，脱脂后固体置100 mL锥形瓶中，按不同料液比加入纯水，在不同温度和不同时间下超声辅助提取山药多糖，冷却并过滤，滤液减压浓缩至10 mL，加入95%乙醇40 mL，在4℃下静置醇沉48 h，过滤，真空冷冻干燥后，得山药粗多糖。

将上述山药粗多糖溶解在5 mL纯水中，利用Sevag法脱蛋白，加入氯仿∶正丁醇（体积比为4∶1）混合溶液，进行多次脱蛋白处理，直至无蛋白层。脱蛋白后多糖水液体装入透析袋（截留分子量3 500 Da），在72 h内用纯水不断更换透析。将透析后的山药多糖水溶液放入真空冷冻干操器内干燥，得到山药多糖M mg，并计算山药多糖的提取率：

1.2.2 多糖含量的测

采用苯酚-硫酸法[6]。以葡萄糖对照品为基准，绘制以浓度X（mg/mL）为横坐标和吸光度Y为纵坐标的标准曲线：Y=64.931X-0.001 8，R2=0.999 1。

1.2.3 Box-Behnken设计-响应面法优化工艺条件

在单因素试验的基础上，以超声提取温度（X1）、超声提取时间（X2）和液料比（X3）为自变量，山药多糖提取率为因变量，并利用Box-Behnken设计试验组，共17 组[11-12]，见表 1。

1.2.4 山药多糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用

参照Anastasia方法[13]，在10 mL容量瓶中加入0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶0.4 mL，不同浓度山药多糖溶液0.2 mL或0.5 mg/mL阿卡波糖溶液0.1 mL，摇匀，置37℃水浴中保温20 min。分别加入2 mmol/L PNPG溶液0.1 mL后，摇匀，置37℃水浴中保温15 min，取出冷却后，分别加入0.5 mol/L Na2CO3溶液1 mL，用纯水定容。分别于405 nm波长下测定吸光度A1。用等量的纯水替代山药多糖溶液作为空白组。计算α-葡萄糖苷酶抑制率公式如下：

表1 因素水平表Table 1 Factor and evel

式中：A0、A1分别为空白组和试验组的吸光度值。

1.2.5 山药多糖的抗氧化性能

1.2.5.1 DPPH·清除能力

山药多糖对DPPH·清除率的测定，参照葛明明等DPPH·清除率测定方法[14-15]。精密移取不同浓度的山药多糖溶液0.2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液0.2 mL，用甲醇定容于1 mL容量瓶中，混合均匀，放置10 min，在517 nm处测定吸光度A。按下式计算DPPH·的清除率。

式中：A样品为不同浓度样品的吸光度；A对照为用甲醇替代0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液的吸光度；A空白为用纯水替代不同浓度样品的吸光度。

1.2.5.2 OH·清除能力

山药多糖对OH·清除率的测定，采用南京建成生物工程研究所提供的OH·自由基测定试剂盒。精密移取不同浓度的山药多糖溶液0.2 mL，按试剂盒说明书操作，于550 nm处测定吸光度A。按下式计算OH·的清除活力：

式中：A样品为不同浓度样品的吸光度；A对照为用纯水替代不同浓度样品的吸光度。

1.2.5.3 O2-·清除能力

山药多糖对O2-·清除率的测定，采用南京建成生物工程研究所提供的抑制超氧阴离子自由基测定试剂盒。精密移取不同浓度的山药多糖溶液0.2 mL，按试剂盒说明书操作，于550 nm处测定吸光度A。按下式计算O2-·的清除率。

式中：A样品为不同浓度样品的吸光度；A对照为用纯水替代不同浓度样品的吸光度。

1.3 数据处理方法

试验数据均按照对应的公式计算，平行测定3次（n=3），所得结果以平均值表示。数据处理及统计分别采用软件origin 9.0和Design Expert 8.0.6。

2 结果与分析

2.1 山药多糖响应面优化分析

2.1.1 试验结果与模型建立

采用Box-Behnken设计试验获得的结果见表2，并应用Design Expert 8.0.6软件对17个试验结果进行多元回归分析，得到以山药多糖提取率为响应值的回归方程：Y=9.34+0.64 ×X1+0.18×X2+0.064×X3+0.16×X1X2+0.31×X1X3+0.60×X2X3-0.62×X12-1.24×X22-0.87×X32。

表2 响应面试验设计和结果Table 2 Response surface design and experimental results

2.1.2 方差分析与显著性检验

方差分析表见表3。

由表3回归方程方差分析结果可知，该模型P＜0.01表示差异具有显著性，失拟项P＞0.05表示差异不显著，说明该模型能较准确地预测提取温度、提取时间和液料比对山药多糖提取率的影响。同时，模型的相关系数R2为0.949 0和RAdj2为0.883 3，表明该模型对多糖提取过程能较好的进行分析和预测。变异系数C.V.值为4.61%，C.V.值越大表明该模型的置信度越高。由表3方差分析中各因素项的P值可知，一次项X1、二次项 X12、X22、X32和交互项 X2X3对山药多糖提取率影响显著，其余项影响不显著，说明各因素与山药提取率不是简单的线性关系。

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

2.1.3 响应面分析与最佳条件确定

图1为以多糖提取率为响应值的4个因素的趋势图，图中等高线可直观地反应出两变量间相互作用程度。

图1C中响应面坡度较陡，表明料液比和提取时间两个因素对山药多糖提取率的影响较大。而图1A和1B中，提取温度一侧的响应面坡度相对于料液比和提取时间要平缓，表明提取温度对山药多糖提取率的响应不灵敏。图1响应面分析结果与回归方差分析结果吻合。

图1 响应曲面3D图Fig.1 Response surface 3D plots for interaction

由Design Expert 8.0.6软件分析计算，获得山药多糖的超声辅助提取工艺的最佳条件，为了方便操作对所获得的最佳工艺条件进行了修正：提取温度为66℃，提取时间为 26 min，液料比 22 ∶1（mL/g），山药多糖的预测提取率为9.55%。在在最佳条件下，重复平行验证试验5次，测得山药多糖提取率为9.34%，与预测值偏差2.20%，表明所得模型能够较好的预测山药多糖的提取情况。

2.2 山药多糖提取率与纯度

利用山药多糖最佳提取条件得到的不同产地的山药多糖，按照“2.1”、“2.2”项下相关方法计算山药多糖的提取率和纯度见表4。

其中河南怀山药的提取率最高为9.43%，纯度为89.15%。山药多糖是山药品质判定的重要理化指标，其含量也直接影响到山药的生物活性，河南怀山药作为山药的道地产区也可能与其多糖含量较高有关系。

表4 4个产地山药多糖提取率与纯度Table 4 Extraction rate and purity of Chinese yam polysaccharide

2.3 山药多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制试验

表5为山药多糖和阳性对照阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制试验结果。

4个产地的山药多糖对α-葡萄糖苷酶都有一定抑制活性，随着质量浓度的增大，山药多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率不断增加，并呈剂量依赖关系。在相同浓度下，4个产地山药多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率大小顺序为：河南怀山药＞祁山药＞安国怀山药＞广西山药。

表5 α-葡萄糖苷酶的抑制率Table 5 Inhibitory rate of α-glucosidase

2.4 山药多糖的抗氧化性能

2.4.1 山药多糖清除DPPH·能力

4种山药多糖对DPPH·的清除率见图2。

图2 4种山药多糖对DPPH·的清除率Fig.2 Removal ability of four Chinese yam polysaccharides toward DPPH·

由图2可知，随着山药多糖质量浓度的增加，山药多糖对DPPH·的清除率增加，在山药多糖质量浓度为5.0 mg/mL时，河南怀山药多糖对DPPH·的清除率可达到71.25%，其次为祁山药。

2.4.2 山药多糖清除OH·能力

4种山药多糖对OH·的清除能力见图3。

图3 4种山药多糖对OH·的清除能力Fig.3 Removal ability of four Chinese yam polysaccharides toward OH·

由图3可知，4种山药多糖对OH·都有较好的抑制能力，随着山药多糖质量浓度的增加，山药多糖对OH·的清除率增加，当质量浓度为5.0 mg/mL时，河南怀山药对OH·的清除率可达到88.35%，其次为祁山药。

2.4.3 山药多糖清除O2-·能力

4种山药多糖的O2-·清除能力见图4。

图4 4种山药多糖的O2-·清除能力Fig.4 Removal ability of four Chinese yam polysaccharides toward O2-·

由图4可知，4种山药多糖对O2-·都有较好的清除能力，随着质量浓度的增大，多糖对O2-·都有较好的抑制能力不断增加，当质量浓度为10.0 mg/mL时，山药多糖对O2-·清除能力增长缓慢，广西山药对O2-·清除能力最高为69.81%，其次为祁山药。

通过试验表明河南怀山药多糖含量最高，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用、对DPPH自由基的清除作用均最优，其符合河南为山药道地产区质优效佳的传统认知。

3 结论

本试验采用Box-Behnken设计-响应面法优化了超声辅助提取山药多糖的工艺条件：提取温度为66℃，提取时间为 26 min，液料比 22 ∶1（mL/g），在此条件下，山药多糖提取率为9.34%。体外试验研究表明，山药多糖对α-葡萄糖苷酶具有较显著的抑制作用，并呈现一定的浓度依赖性，当4个产地山药多糖浓度为30 mg/mL，河南怀山药多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率达到44.03%，其次为怀山药39.43%。与阳性对照阿卡波糖相比，山药多糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用均低于阿卡波糖，但山药多糖也显示出较强的抑制作用。山药多糖抗氧化活性研究显示，当山药多糖浓度为5.0 mg/mL时，河南怀山药多糖对DPPH·的清除率可达到71.25%；当山药多糖质量浓度为5.0 mg/mL时，河南怀山药对OH·的清除率可达到88.35%；当山药多糖浓度为为10.0 mg/mL时，广西山药对O2-·清除能力最高为69.81%。本试验结果显示河南怀山药和祁山药的品质好，符合河南怀山药和祁山药质量优良的道地产区传统认知。