骏枣精油的超临界CO2萃取工艺及其组成分析

徐恒，蒲云峰，奚倩，黄英，侯旭杰

（塔里木大学生命科学学院，南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔843300）

红枣（Ziziphus jujuba Mill．），又名大枣、华枣、干枣等，是鼠李科枣属植物的成熟果实，除供鲜食外，多制成干枣、枣泥、枣酒、枣饮料等产品[1-3]。在我国，大枣的栽培历史悠久，种植区域广泛，有700余个品种，如灰枣、骏枣、金丝小枣等[4-5]。红枣不仅富含多糖、三萜、氨基酸、环磷酸腺苷等生物活性成分，而且还拥有独特的焦糖香[6-7]。红枣精油是利用不同加工工艺技术从红枣中提取获得的，其纯度高、香型逼真且香气强度高[8]。馥郁的枣香气味，可作为天然食品添加剂的来源，具有增进食欲、促进消化液的分泌等作用，在食品、药品、保健品、烟草及化妆品当中应用广泛，具有极大的市场应用前景[9]。

目前红枣精油的制备多采用有溶剂萃取或水蒸气蒸馏等方法，但其产物香型多变、萃取率低、溶剂残留大、香气强度低；而超临界二氧化碳萃取适于不稳定天然产物的分离精制，具有萃取纯度高、无毒、无残留等优点[10-12]。

近年来，对红枣香味的研究大多集中于温度对香味物质形成的影响，有关红枣香气自身的提取分析鉴别相关研究较少[13-14]。本研究优化了超临界二氧化碳萃取红枣精油工艺，采用顶空-固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）对骏枣精油挥发性香味物质进行了分离萃取及分析检测。其结果为红枣天然食品添加剂的开发及香味评价提供理论依据，拓展了红枣开发新方向，提高了红枣的综合利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆骏枣（干枣）：新疆阿克苏市皖疆农民生产合作社，2018年10月当季收获。

CO2（纯度99.8%）：新疆阿拉尔市小李氧气店；乙醇（国产分析纯，纯度99.8%）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Spe-ed SFE-2型超临界萃取装置：美国ASI公司；7890B-7000D气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司；SAAB-57328U SPME手动进样柄、手动萃取头（50/30UM DVB/CAR on PDMS）：上海安普公司；低温恒温循环器：南京新辰生物科技有限公司；DZF-6210电热恒温烘箱：上海一恒科学仪器有限公司；CFB高速万能粉碎机、AR2140电子天平：奥豪斯国际贸易有限公司；Talboys数显型磁力加热搅拌器。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

挑选大小均匀一致无机械损伤的骏枣，去除果柄、果核，清洗干净；恒温60℃烘烤24h后升温至120℃继续烘烤0.5 h；冷却后粉碎；过40目筛；得骏枣干果粉末，－20 ℃密封避光保存[15]。

1.3.2 骏枣精油提取制备

称取骏枣干粉200.0 g，装入1.0 L的萃取釜中，以无水乙醇为夹带剂，打开冷却系统，设定萃取釜压力及温度，打开CO2阀门，检漏后保持预设温度和压力，调节夹带剂泵流速，开始加压萃取。萃取达到预定时间，收集提取物，称量瓶称重，计算红枣精油的得率[16]。

1.3.3 单因素试验

采用控制变量法，选取对超临界CO2萃取精油效果影响较大的因素分别进行单因素试验，以精油得率为考察指标。预设萃取时间分别为 0.5、1、2、3、4、5、6、7 h，萃取压力分别为 20、25、30、35 MPa，萃取温度分别为 25、30、35、40、45 ℃，夹带剂种类为水、乙醇、甲醇，夹带剂流速分别为 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4 mL/min。在其它因素不变的情况下，考察单个因素对精油得率的影响，每个因素考察3次，取平均值。

1.3.4 正交试验优化红枣精油提取条件

对压力、温度、夹带剂流速3个因素进行单因素分析，根据试验结果，确定出较适宜的条件，以骏枣精油提取得率为评价标准，对压力、温度、夹带剂流速3个因素进行L9（33）的正交试验，见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.3.5 HS-SPME的分离富集

萃取头老化：在230℃的温度下，将50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取头保持进样状态，老化90 min，去除杂质，确保无干扰杂峰出现。

将骏枣精油置于15.0 mL玻璃管中，加入搅拌转子，用9.5 mm，pk25玻璃管配套隔垫密封，将其置于数显型磁力加热搅拌器中。在50℃、200 r/min条件下平衡20 min，然后将已老化好的萃取头安装在SPME操作平台上，萃取头距离玻璃管中距液面1 cm处，萃取30 min，进行 GC-MS 分析[17]。

1.3.6 GC-MS红枣精油成分分析[18-19]

GC条件：VF-WAXms毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；前进样口温度240℃，升温程序：起始温度40℃，保持5 min，以5℃/min升温速率升至120℃，保持10 min，以8℃/min升温速率升至180℃，保持10 min，最后以10℃/min升温速率升至230℃，保持10 min；进样量为 0.8 μL；分流进样，进样比为 10 ∶1；以He为载气，流速为0.8 μL/min；时间间隔为1 s。

MS条件：电喷雾离子源（ESI）；电离能为70 eV；接口温度为240℃；离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；扫描范围m/z 30～450。

1.3.7 定性分析

对检出成分的质谱图数据与NIST.14质谱库的质谱图进行检索和人工分析比对，选择80%以上的匹配度作为物质鉴定依据，并通过查阅文献及相关质谱资料，对样品中各挥发性化学成分进行定性分析[20]。用峰面积归一化法，即以组分峰面积占总峰面积的百分比来计算得到各组分的相对含量[21]。

2 结果与分析

2．1 萃取条件选择

2.1.1 夹带剂对骏枣精油萃取得率的影响

不同夹带剂对骏枣精油萃取得率的影响见图1。

由图1可知，当乙醇溶液作夹带剂时，萃取效果远好于水和甲醇做夹带剂时萃取效果，这与曹艳萍[16]等采用超临界CO2萃取滩枣精油工艺中，夹带剂选择相同。故超临界萃取骏枣精油夹带剂选择乙醇。

图1 不同夹带剂对骏枣精油萃取得率的影响Fig.1 Effect of different entrainers on extraction rate of jujube essential oil

2.1.2 时间对骏枣精油萃取得率的影响

不同萃取时间对骏枣精油萃取得率的影响见图2。

图2 萃取时间对骏枣精油萃取得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of jujube essential oil

由图2所示，超临界萃取初期，骏枣精油的萃取得率随着时间的增加而迅速增加。当萃取时间在0至2 h时萃取率增速最快，此后萃取率增幅降低，萃取3 h后其萃取量基本保持不变，这是因为萃取釜中骏枣的精油含量有限，经过3 h的萃取已基本分离完全。即超临界CO2萃取骏枣精油萃取时间定为3 h为宜。

2.1.3 压力对骏枣精油萃取得率的影响

不同萃取压力对骏枣精油萃取得率的影响见图3。

由图3所示，不同萃取压力对萃取骏枣精油含量有所不同，压力在25 MPa时萃取率达到最大。初期随着萃取釜压力的增大，提高了流体密度，增加CO2对精油的溶解度，从而提高了萃取率，但当压力超过25 MPa后，随着压力进一步增大，萃取釜内压力过高导致枣粉过度黏结，影响精油的萃取效果。因此，选取25 MPa为萃取压力较好。

2.1.4 温度对骏枣精油萃取得率的影响

不同萃取温度对骏枣精油萃取得率的影响见图4。

图3 萃取压力对骏枣精油萃取得率的影响Fig.3 Effect of extraction pressure on extraction yield of jujube essential oil

图4 萃取温度对骏枣精油萃取得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of jujube essential oil

由图4所示，在压力一定的条件下，骏枣精油的得率随萃取温度的提高而增加，当温度达到35℃时萃取得率达到1.162%。温度升高，CO2分子热运动加快，溶质的传质系数增大、挥发性和扩散速度都有所提高，有利于香味溶质的萃取。但是，当温度继续加大，CO2分子间间距进一步增大，密度降低，分子间作用力变小，溶解能力降低，同时萃取釜中温度与压力构建的超临界平衡点被打破，萃取率也会降低，且过高的温度会导致精油中的挥发性香气物质损失加剧[22]。因此，选取35℃为萃取温度较好。

2.1.5 夹带剂流速对骏枣精油萃取得率的影响

不同夹带剂流速对骏枣精油萃取得率的影响见图5。

由图5所示，在压力、温度一定的条件下，骏枣精油的得率会随着夹带剂流速的变化而变化，在夹带剂未进入前其萃取率为0.630%，当夹带剂流速缓慢增加时，萃取得率呈现先减小再增加而后又降低的变化。其夹带剂流速达到0.3 mL/min时，萃取得率达到最大。夹带剂对超临界CO2溶解能力的影响比较复杂，当加入一定量无水乙醇作夹带剂时，可改变超临界CO2的极性，拓宽其溶解范围，改变溶质分子间范德华力，增强CO2的溶解力，使其萃取率提高。但当夹带剂使用量较低时，对CO2的极性影响不显著，精油萃取率稍稍有所降低；当夹带剂使用量超过临界点时，反而造成CO2密度下降其溶解度降低[23]。因此，选取0.3 mL/min无水乙醇作夹带剂时萃取效率较好。

图5 夹带剂流速对骏枣精油含量的影响Fig.5 Effect of entrainer flow rate on the content of jujube essential oil

2.2 正交试验

萃取时间对萃取效果影响差异不大，而夹带剂的影响较为明显，因此固定萃取时间为3 h，以无水乙醇作夹带剂，在单因素试验的基础上，研究萃取压力、萃取温度、夹带剂流速相互之间对萃取率的影响，设计正交试验见表2，正交试验结果的方差分析见表3。

表2 超临界CO2萃取优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for supercritical CO2extraction conditions optimization

表3 正交试验结果的方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

由表2可知，比较直观分析结果中极差R值，各因素对萃取精油效果的影响强弱顺序为A＞B＞C。由表3分析可得A因素对得率的影响显著，B、C因素对得率无显著性，两种分析结果一致，即萃取压力影响最显著，温度次之，夹带剂流速对精油的提取影响最小。

由极差分析法计算结果K值可知，正交因素的最优水平组合为A2B2C2，即萃取压力25 MPa，萃取温度35℃，夹带剂流速3 mL/min。加做验证性试验，取3次试验结果平均值，精油萃取率为1.196%。而从表2中可直观地可以找出9个处理中最优水平组合为4号处理，即A2B1C2，萃取压力25 MPa，萃取温度32℃，夹带剂流速3 mL/min，其萃取率达到1.224%。比正交最优组合处理精油萃取量大，即最优萃取工艺条件为确定为A2B1C2。

2.3 骏枣精油的HS-SPME-GC-MS成分分析

利用GC-MS联用技术对骏枣精油进行挥发性香气物质测定，其总离子流图如图6所示。

图6 GC-MS测定骏枣精油挥发性成分色谱流出图Fig.6 GC-MS determination of chromatographic efflux of volatile constituents of jujube essential oil

由图6可知色谱图峰形窄而尖，峰个数多，说明该条件对骏枣精油挥发性成分萃取效果较好。挥发性香气物质分析如表4所示。

由图6、表4可知，从骏枣精油挥发性物质中共分离检测到68种物质，其中确定结构的有59种，占总峰面积的91.737%，酸类、烷烃类、酮类和酯类相对含量较高，是构成骏枣精油香味主要组分。其中酸类化合物19种，相对含量48.872%，主要是稍微带有刺激气味的乙酸、正癸酸以及含有杏仁气味苯甲酸含量较高，其次是果香味的月桂酸和呈现脂肪味、难闻气味的己酸、壬酸。酸类化合物占比较高可能是骏枣在上糖心过程或采摘后储藏过程中，由发酵产生的部分乙酸，也可能是烘干及超临界萃取过程中不饱和脂肪酸热氧化分解的产物，这与骏枣果肉口感发酸结果相符[24-25]；酯类物质6种，相对含量5.374%，以香料溶剂甲基丙烯酸异癸酯为主，酯类的种类和相对质量分数相对较少，可能是高温使酯合酶失活以及与美拉德反应有关[24]；醇类物质6种，相对含量3.464%，含有焦糖香味的麦芽醇占比较高，其它醇类物质多给精油提供花香、醇香等风味，一般是脂肪氧化酶等生物酶作用下不饱和脂肪酸和一些氨基酸直接形成的醇类香味物质[26]；醛类物质3种，相对含量3.488%，具有杏仁气味的糠醛和苯甲醛，以及焦糖香味的5-羟甲基糠醛。糠醛是抗坏血酸在加热，有氧的条件下降解生成的醛类物质[27]，5-羟甲基糠醛是拟除虫菊酯烯丙菊酯和烯炔菊酯的中间体，是美拉德反应的产物，一般多作烟用香精等[6]；酮类物质4种，相对含量6.877%，具有奶香味的3-羟基-2-丁酮含量最多，醛酮类挥发性物质的相对质量分数最少，可能是因为与其它化合物结合更强；烷烃类物质12种，相对含量19.485%，研究证明脂肪烷烃物质的生成其重要途径之一是美拉德反应，但这些烃类物质的形成机制以及对枣精油香味构成的影响有待进一步研究[28-30]；酚类物质2种，相对含量0.753%；其它化合物分别为7种，相对含量3.424%。

表4 骏枣精油挥发性物质组成及含量Table 4 Composition and content of volatile substances in of the jujube essential oil

续表4 骏枣精油挥发性物质组成及含量Continue table 4 Composition and content of volatile substances in of the jujube essential oil

续表4 骏枣精油挥发性物质组成及含量Continue table 4 Composition and content of volatile substances in of the jujube essential oil

3 结论

采用正交试验设计优化超临界二氧化碳萃取骏枣精油工艺条件，最佳提取工艺参数为：乙醇作携带剂，萃取压力25 MPa，萃取温度32℃，夹带剂流速0.3 mL/min，萃取时间3 h，骏枣精油的萃取率可达1.224%。经方差分析和试验验证，此工艺参数合理可行，与曹艳萍等[16]采用超临界CO2萃取滩枣精油工艺得率1.51%相比略少，但两者选用原料有所差异，夹带剂加入方式不同。后续利用HS-SPME-GC-MS联用技术对骏枣精油挥发性香味物质组成进行分析，共检出68种物质，结构推断59种，占总峰面积的91.737%，其中主要包括酸类、烷烃类、酮类、酯类以及少量的醛类、醇类等，这与王颉等[31]早年研究枣挥发油的提取及化学成分的气相色谱-质谱分析中物质鉴别相似。各类物质中焦糖香味的麦芽醇和5-羟甲基糠醛，杏仁气味苯甲酸和糠醛，以及奶香气味的3-羟基-2-丁酮都可能是骏枣精油的主要香气成分。