山楂不同溶剂提取物的抗氧化活性及对DNA和蛋白质氧化损伤的保护作用

张亮亮，张展诺，闫可婧，额日赫木，张丽芳，徐建国，*

（1.山西师范大学化学与材料科学学院，山西临汾041004；2.山西师范大学食品科学学院，山西临汾041004；3.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge），又名红果、山里红等，属蔷薇科，是一种多年生木本植物，在我国北方广泛种植。山楂是卫生部批准的药食两用水果，营养丰富，具有消食健胃、行气散瘀的功效[1-2]。许多研究表明，山楂富含维生素C（890 mg/kg FW）、多糖（10.23%～14.25%）、多酚（61.84 mg RE/g）、黄酮（33.56 mg GAE/g）等功能性物质，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、降血糖、降血脂和神经保护等活性作用[1-6]。钟丽霞等[6]优化了山楂多糖的提取条件，并表明山楂粗多糖具有一定的降血糖、降血脂活性；何彩梅等[7]研究了山楂70%乙醇提取物的组成成分及抗氧化能力；张晓波等[8]研究了不同品种山楂80%丙酮提取物的抗氧化能力；努尔阿丽耶·阿卜力米提等[4]研究了新疆山楂水和乙醇提取物的清除自由基能力及抑菌作用。除此之外，研究表明山楂原花青素可通过影响抗氧化酶活力和细胞凋亡相关蛋白来抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖，促进细胞凋亡[5]。

但目前有关不同溶剂对山楂提取物的活性物质含量及其生物活性影响的研究还未见详细报道。为有效开发山楂资源，本文对山楂不同溶剂提取物的抗氧化活性进行了初步研究。本研究以山楂为材料，采用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等6种不同极性的溶剂分别提取山楂中的总黄酮、总多酚类物质，分析其主要的化学成分，研究不同溶剂提取物的抗氧化能力及其对DNA和蛋白质氧化损伤的保护作用，为山楂资源的开发利用及功能食品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

大金星山楂：10月上旬采摘于本地果园，经去核、晾干后粉碎，密封低温保存备用。儿茶素、绿原酸、原花青素B2、表儿茶素、槲皮素、对苯二甲酸、金丝桃苷、异槲皮苷：上海源叶生物科技有限公司；1，1苯基-2-苦 肼 基 自 由 基 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-3-乙苯-二噻唑-6 磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、Fe3+-三吡啶三吖嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：Sigma公司；pBR322质粒DNA：大连宝生物公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：天津市科密欧化学有限公司。

RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；Centrifuge 5804R型冷冻离心机：德国Eppendorf公司；Agilent 1100型高效液相色谱仪：美国Agilent公司。

1.2 试验方法

1.2.1 提取物制备

准确称取干燥的山楂，粉碎过40目筛，按照1∶10（g/mL）的料液比，分别加入不同溶剂，25℃振荡2 h，收集上清液，重复3次。将上清液混合后减压浓缩，将得到的浸膏经真空冷冻干燥，分别得到甲醇提取物（methanol extract，ME）、乙醇提取物（ethanol extract，EE）、丙酮提取物（acetone extract，AE）、乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract，EAE）、氯仿提取物（trichloromethane extract，TE）和石油醚提取物（petroleum ether extract，PE）。

1.2.2 总黄酮含量测定

参照文献[9]的试验方法，称取一定量的提取物，溶解，取0.1mL样液，加入0.15mL5%NaNO2溶液，25℃放置6 min后加入0.15 mL浓度为10%的Al（NO3）3溶液，反应6 min，加入4%的NaOH溶液2 mL，并用蒸馏水定容到5 mL，反应3 min后，测定混合液在508 nm处的吸光度值。同时以芦丁标品溶液做标准曲线，拟合的回归方程y=2.403 5x+0.004 9（R2=0.999 2）。总黄酮含量测定结果以每克山楂中所含的芦丁（rutin）的量表示（mg RE/g）。

1.2.3 总多酚含量测定

参照文献[9]的试验方法，准确移取0.1 mL样液，向其中加入2.8 mL蒸馏水，0.1 mL 1 mol/L的Folin-酚试剂，混匀，25℃避光反应8 min，再加入2 mL 7.5%Na2CO3，避光2 h，测其在765 nm处的吸光度值。以没食子酸标品溶液做标准曲线，拟合回归方程为y=1.558 2x+0.008 2（R2=0.999 6）。总多酚含量的测定结果以每克山楂中所含的没食子酸的量表示（mg GAE/g）。

1.2.4 组成成分分析

提取物的成分分析方法参照文献[10]略作修改。选用 C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），采用三氟乙酸（1%）作为流动相 A，用乙腈/甲醇（80∶20，体积比）作为流动相B。进样量为10 μL，柱温保持在35℃，流动相下洗脱流速1 mL/min，洗脱过程为：0～5 min，3%B；5min～12min，3%～10%B；12min～25min，10%～18%B；25 min～35 min，18%～20%B；35 min～40 min，20%～80%B；40 min～45 min，80%～3%B；45 min～50 min，3%B。各组分在280 nm的吸光度值被检测。标准品儿茶素、绿原酸、原花青素B2、表儿茶素、槲皮素、对苯二甲酸、金丝桃苷、异槲皮苷在同样的条件下进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析，并以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。样品成分根据对比标准品的保留时间定性，含量根据标准曲线计算。

1.2.5 DPPH自由基清除能力测定

参考文献[11]的方法，量取500 μL不同浓度的山楂提取物于试管中，添加2.5 mL的DPPH溶液，避光反应30 min，测量其在517 nm波长处的吸光度值，计算DPPH自由基清除率，清除能力以IC50（自由基清除率为50%时添加的提取物的浓度）表示。

1.2.6 ABTS自由基清除能力测定

参考文献[11]的方法，量取100 μL不同浓度的山楂提取物于试管中，添加3.8 mL的ABTS溶液，避光反应6 min，在734 nm处测定吸光度值，计算ABTS自由基清除率，清除能力以IC50（自由基清除率为50%时添加的提取物的浓度）表示。

1.2.7 铁还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定

参考文献[11]的方法，量取100 μL山楂提取物于试管中，加TPTZ溶液1.8 mL，37℃反应30 min，立即记录反应体系在593 nm处的吸光度值。同时以FeSO4·7H2O 做标准曲线（100 μmol/L～1 000 μmol/L），得回归方程为 y=0.000 6x+0.003 5（R2=0.993 8），铁还原能力结果以每克山楂相当于μmol Fe（II）表示（μmol Fe（II）/g）。

1.2.8 蛋白质氧化损伤的保护试验

试验方法参考文献[12]，量取5 μL1 mg/mL的牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，依次加入5 μL 山楂提取物、5 μL 磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS） 缓冲溶液、2.5 μL10 mmol/L 的硫酸铜溶液和 2.5 μL 双氧水（50 mmol/L），摇匀，放入 37℃水浴1 h。空白组用PBS缓冲液替代山楂提取物。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）检测蛋白质，在凝胶成像记录仪中拍照，并通过灰度值计算其相对保护率。

1.2.9 DNA氧化损伤的保护试验

试验方法参考文献[11]，取1 μL的pBR322 DNA，加入 14 μL 的 PBS 缓冲溶液（pH 7.4），5 μL 山楂提取物，然后加入2.5 μL 1 mmol/L的硫酸亚铁溶液和2.5 μL 1 mmol/L双氧水，混合均匀并置于37℃水浴中反应30 min，取出后立即进行琼脂糖电泳检测，在凝胶成像记录仪中拍照，并通过灰度值计算其相对保护率。

1.3 数据处理

所有试验重复3次，数据结果表示为平均值±标准偏差。数据采用Excel 2013、SPSS 24.0软件进行统计学分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同提取物中总黄酮、总多酚含量

山楂不同溶剂提取物的总多酚和总黄酮含量测定结果见图1。

图1 不同溶剂提取物中总黄酮和总多酚含量Fig.1 Contents of total phenolics and flavonoids of different solvents extracts

由图1得知，不同提取物中的总黄酮含量存在明显差异，其中ME中总黄酮的含量最高（61.84mgRE/g），其次为 EE（44.42 mg RE/g）、AE（12.78 mg RE/g）、EAE（3.08 mg RE/g）、TE（2.59 mg RE/g），PE中总黄酮含量最低为0.59 mg RE/g。与总黄酮含量的变化相似，ME中总多酚含量最高为38.40 mg GAE/g，EE中多酚含量为37.99 mg GAE/g，但ME和EE二者之间总多酚含量无显著差异；其余提取物中总多酚含量由高到低依次为 AE（33.56 mg GAE/g）、EAE（17.12 mg GAE/g），TE（4.48 mg GAE/g）和 PE（2.66 mg GAE/g）。试验结果表明，随着提取溶剂极性的不断增加，山楂中总黄酮和总酚类物质的溶解程度也随之增加，这与一些以前的研究报道相一致[9，13]，符合酚类物质主要为溶解在中等和高极性溶剂中的特征。然而提取剂极性与酚类物质含量并非一一对应，如田强等[14]报道厚朴叶的乙醇提取物中的总酚含量远远高于其甲醇提取物；陆健等[15]报道大麦的丙酮提取物中多酚的含量大于甲醇提取物。这些差异可能与原料种类、产地、提取方法及其酚类物质的组成成分有关。

2.2 不同提取物的成分组成

不同提取物成分含量见表1。

表1 不同提取物成分含量Table 1 Chemical components in extracts of different solvents mg/100 g DW

由表1可知，不同溶剂提取物中含有的物质种类和含量存在明显差异，在ME、EE和AE中检测到全部8种物质，EAE未检测到异槲皮苷，TE中检测到6种物质，而PE中只检测到原花青素B2、表儿茶素和金丝桃苷3种物质。总的来看，每种提取物中，表儿茶素和原花青素B2的含量较高，其次为绿原酸、槲皮素。EE中含有最高的儿茶素，其次为ME和AE；而对于其他每种物质成分，其含量最高的被发现在ME中，其次为EE、AE、EAE、TE 和 PE。

2.3 不同提取物清除DPPH自由基和ABTS自由基能力

山楂不同提取物的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力结果见表2。

表2 不同溶剂提取物的自由基清除能力Table 2 DPPH and ABTS free radicals scavenging ability of different solvent extracts

不同提取物对DPPH自由基和ABTS自由基具有不同程度的清除作用，在测定浓度范围内均呈线性关系。ME和EE清除DPPH自由基能力显著强于其它提取物，其 IC50值分别为 2.43、3.22 mg/mL，其次为 AE、EAE、TE和PE。不同提取物对ABTS自由基的清除能力与DPPH自由基的清除能力相一致，清除能力由强到弱依次为 ME＞EE＞AE＞EAE＞TE＞PE。

2.4 山楂提取物的铁还原能力

山楂不同溶剂提取物的铁还原能力测定结果见图2。

图2 不同溶剂提取物铁还原能力Fig.2 FARP value of different solvent extracts

由图2可以看出，提取溶剂对提取物的铁还原能力有显著的影响。ME的铁还原能力最强，为2.88 mmol Fe（II）/g，其次为 EE（2.17 mmol Fe（II）/g）和AE（0.91 mmol Fe（II）/g）；EAE、TE 和 PE 的铁还原能力没有显著差异，分别为 1.74、1.12、1.08 mmol Fe（II）/g，远远低于其它提取物。

2.5 不同提取物对蛋白质氧化损伤的保护效果

Cu2+、Fe2+、Fe3+等金属离子可以催化双氧水，产生能与氨基酸反应的·OH[16]，本试验通过Cu2+-H2O2体系产生·OH，诱导蛋白质的氧化损伤，考察山楂提取物对蛋白质损伤的保护作用，试验结果见图3。

图3 不同溶剂提取物对蛋白质损伤的保护效果Fig.3 Protective effects of different solvent extracts on protein oxidative damage

在蛋白质氧化损伤的反应体系中，提取物可能会通过直接清除羟基自由基来保护蛋白质[17]。不同溶剂提取物处理组中，ME对蛋白质的保护率达到了55.78%，其次为EE、AE对蛋白质的保护率分别为53.12%和37.25%，EAE对蛋白质的保护率为25.94%，而TE和PE对蛋白质的氧化损伤基本上起不到保护作用。

2.6 不同提取物对DNA氧化损伤的保护效果

天然存在的pBR322 DNA呈超螺旋结构，受外界因素损伤导致其中一条链断裂变为开环形，两条链断裂变为线型，通过检测pBR322 DNA构象的改变，可反映DNA氧化损伤程度[18-19]。山楂提取物对DNA损伤的保护作用结果见图4。

由图4可知，ME、EE对DNA的氧化损伤具有较好的保护作用，保护率分别达到了74.14%、63.17%，AE对DNA氧化损伤的保护率为31.35%，EAE为17.06%，TE和PE对DNA氧化损伤没有保护作用，保护率仅为2.41%和0.43%。

2.7 总多酚、黄酮含量与生物活性的相关性分析

山楂提取物中总多酚、总黄酮含量与其生物活性的相关性分析结果见图5。

图4 不同溶剂提取物对DNA损伤的保护效果Fig.4 Protective effects of different solvent extracts on DNA oxidative damage

图5 总多酚、黄酮及生物活性的相关性分析Fig.5 Correlation analysis of total polyphenols，flavonoids and biological activities

不同溶剂提取物中总酚含量、黄酮含量与其抗氧化能力、蛋白质和DNA氧化损伤保护能力呈正相关，相关系数均不小于0.794，且相关性显著（P＜0.05）。这些结果与以前的一些报道相一致[14，20-21]，说明山楂提取物总多酚、黄酮含量的多少可以反映其抗氧化能力及其对蛋白质和DNA氧化损伤保护能力的强弱。除此之外，提取物的抗氧化能力、蛋白质和DNA氧化损伤保护能力之间的相关性亦呈显著正相关，说明这几种方法适合测定并能综合反应山楂提取物的抗氧化能力

3 结论

本研究比较了山楂不同溶剂提取物的总多酚和总黄酮含量，随着提取溶剂极性的增强，提取物中总多酚和总黄酮的含量随之增加，即ME＞EE＞AE＞EAE＞TE＞PE，表明山楂中极性多酚的含量较高。

分析测定了提取物的组成成分、体外生物活性及其相关性。通过5种评价体系可知，山楂的不同溶剂提取物中ME、EE和AE表现出较好的抗氧化能力及其对蛋白质和DNA氧化损伤保护能力，而EAE、TE和PE的生物活性相对较弱，山楂提取物中总多酚和总黄酮含量与其生物活性具有显著正相关性。本试验通过研究不同溶剂对山楂提取物活性成分及其生物活性的影响，为山楂资源的深度开发提供参考，但其活性单体的分离纯化、生物活性及其之间相互作用，均有待于进一步深入研究和探讨。