西瓜噬酸菌调控因子aryR的基因功能分析

田二渊 关巍 王铁霖 黄洋 刘堰凤 刘博 杨玉文 赵廷昌

摘 要： 瓜類细菌性果斑病是危害葫芦科作物的世界性病害，其病原菌为西瓜噬酸菌 （Acidovorax citrulli）。以西瓜噬酸菌野生型菌株Aac-5为研究对象，构建了转录调控因子aryR的全基因缺失突变株，并构建了互补菌株。测定了野生型、突变株和互补菌株的致病性、致敏性、生物膜形成能力和运动能力等生物学特性。同时，使用qRT-PCR 定量检测了鞭毛基因fliR和fliC以及III型分泌系统功能基因hrpE和hrcN 的表达水平。结果显示，aryR的缺失降低了Aac-5对西瓜的致病力和运动能力，增强了生物膜形成能力，对非寄主烟草仍具有致敏性。hrpE、hrcN、fliR、fliC基因在突变株中的表达量下调，表明aryR对hrpE、hrcN、fliR、fliC基因均为正调控。综上所述，基因aryR在Aac-5致病过程、运动能力和其他表型中起着重要的调控作用。

关键词： 西瓜噬酸菌; 转录调控因子; aryR; 致病性; 运动能力

中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2020）02-008-09

Functional study on the global regulation factor aryR of Acidovorax citrulli Aac-5 strain

TIAN Eryuan1，2， GUAN Wei2， WANG Tielin3， HUANG Yang2， LIU Yanfeng2， LIU Bo2， YANG Yuwen2， ZHAO Tingchang2

（1. Jilin Agricultural University， Changchun 130118， Jinlin， China; 2. State Key Laboratory of Biology of Plant Diseases and Insect Pests/Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 3. State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs/National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijng 100700， China）

Abstract： Bacterial fruit blotch（Acidovorax citrulli）is a serious worldwide disease on cucurbitaceous plants. In this study， a full-gene deletion mutant strain of the global regulatory factor aryR was constructed based on the wild-type strain Aac-5 of A. citrulli through homologous recombination， as well as the complementation strain. The virulence， hypersensitive on tobacco， swimming and twitching motility and the ability of biofilm formation of the wild-type strain， mutant and complementation strain was determined. The expression of flagellum-assembly genes fliR and fliC， and Type III secretion -related genes hrpE and hrcN were also quantitatively assessed by using qRT-PCR. The results showed that compared with the wild type， the virulence， twitching and swimming motilities was decreased in mutant strain， while its biofilm formation ability was increased. The ability of aryR mutant strain on causing hypersensitive reaction on non-host tobacco was maintained. Compared to the wild-type strain， the fliR and fliC genes were lowly expressed in the mutant strain， and the hrpE and hrcN genes were also lowly expressed， suggesting that the aryR positively regulates fliR， fliC， hrpE， and hrcN genes in Aac-5 strain of A. citrulli. In summary， the aryR plays an important role in regulating the virulence， twitching and swimming motilities and biofilm formation of A. citrulli Aac-5 strain.

Key words： Acidovorax citrulli; Translation regulatory factorr; aryR; Virulence; Motility

自然环境是复杂多变的，生存在其中的微生物为了适应环境因此进化出了一套高效的调控系统[1]，例如群体感应系统（Quorum sensing， QS）与双组份系统等。LuxR家族转录调控因子是QS系统中广泛存在的调节因子，近年来研究表明，基因组中存在许多LuxR同源蛋白在行使调控功能。目前发现，在苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等大约70余种革兰氏阴性菌中存在类似的LuxR型QS模式系统，行使对生物被膜的形成[2]、毒力因子金属蛋白酶活性[3]、致病性及细胞毒性、细菌游动能力、T3SS相关蛋白（ExoS、PcrV）表达、绿脓素合成量、喹诺酮QS系统信号分子合成[4]等多种行为的调控作用。除了参与群体感应的LuxR蛋白外，还有一部分LuxR家族蛋白可以单独或以双组份调控系统的形式参与细菌生命活动的调控[5]。伯克氏菌（Burkholderia cenocepacia）中的CepR与cepI和aidA基因的启动子结合表现出协同作用行使细菌群体移动、生物膜形成等功能[6]，梨火疫病菌（Erwinia amylovora）LuxR转录调控因子的EaluxR突变株对于梨叶及梨幼果的致病性明显减弱，在NA液体培养基上的生长速度明显减慢，对耐过氧化氢及胞外多糖产生能力明显减弱，但是，对烟草过敏性反应、抗生素耐性、生物膜形成没有任何影响[7]。

瓜类细菌性果斑病（Bacterial fruit blotch，BFB）的病原菌为西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli），為革兰氏反应阴性[8]，主要侵染西瓜、甜瓜等葫芦科作物，是世界范围内的检疫病害[9]。2007年刘鹏等[10]利用生物学方法证明西瓜噬酸菌存在群体感应系统，西瓜噬酸菌II组菌株AAC00-1的群体感应系统对病菌的致病力、生长能力、运动能力有不同程度的调控作用[11]。同时前期研究表明，西瓜噬酸菌的全基因组中LuxR家族共有13个LuxR同源蛋白基因[12]，参与西瓜噬酸菌的行为调节。其中aacR基因编码的AacR蛋白是参与群体感应的LuxR家族转录调控因子，该基因的缺失导致西瓜噬酸菌致病力、生物膜形成能力和运动能力等与群体感应相关的表型发生显著改变[5，13]。luxR（Aave-4229）对西瓜噬酸菌致病力、运动能力及生物膜的形成具有重要调控作用[5]。

在西瓜噬酸菌AAC00-1基因组（NCBI accession number：NC_008752）中基因Aave_1577编码一个LuxR家族转录调控因子AryR。根据亲缘关系预测结果，该转录因子与水稻白叶枯病菌的OryR单独成簇，蛋白的三级结构和水稻白叶枯病菌的OryR蛋白非常相似，其蛋白氨基端没有任何典型的结构域，羧基端有保守的螺旋-转角-螺旋结构域，故命名为AryR。OryR蛋白与水稻白叶枯病菌的毒性有关[14]，可与目的基因的启动子进行特异性结合以表达相关基因[15-16]。OryR蛋白能够响应植物信号并且激活邻近pip基因及相关能动基因的表达[16-18] ，它是宿主与病原菌之间交流的重要调控蛋白。水稻白叶枯菌没有LuxI家族AHL合成酶，不产生AHL信号分子，在这种情况下，OryR会与另外一种未知信号分子结合，而这种信号分子是由植物本身产生的小分子物质，当水稻白叶枯菌感染水稻时，OryR蛋白浓度增加，表明 LuxR家族蛋白也可以检测到真核生物产生的非AHL信号物质[6]。为了探明AryR蛋白与果斑病的特性相关性，笔者根据该全基因组序列提供的信息，分析了AryR的结构域特征，以aryR基因为研究对象，探究该基因缺失后对Aac-5致病力和其他相关表型的影响，以期初步探索aryR在Aac-5致病机制中的调控作用，进而为防治瓜类细菌性果斑病提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株、质粒及引物 所用菌株和质粒详见表1。

1.1.2 试剂及仪器 细菌基因组DNA提取试剂盒（百泰克（北京）生物技术有限公司）、核酸限制性内切酶（宝生物工程（大连）有限公司）、抗生素（Sigma-Aldrich公司（美国））、高保真酶KOD plus Neo（东洋纺（日本）），试验所用引物由华大基因（北京）合成。研究中所用到的仪器有精密恒温培养箱（BPH-9082）、PCR仪（T100TM Thermal Cycler）、电泳仪（DYY-8C）、紫外可见分光光度计（Nano VuePlus）等。

1.1.3 培养基 （1）Kings B培养基（pH=7.0，蒸馏水定容至1 L）：胰蛋白胨（Tryptone）20 g;K2HPO4 1.5 g;MgSO4·7H2O 1.5 g;丙三醇 （Glycerol） 15 mL。加蒸馏水至1 L，灭菌备用。固体培养基加琼脂粉（Agar），比例为1.5%;高蔗糖培养基为在KB固体培养基内加10%的蔗糖。（2）LB培养基（pH=7.0，蒸馏水定容至1 L）：胰蛋白胨（Tryptone）10 g;氯化钠 （NaCl ）10 g;酵母粉 （Yeast）5 g。加蒸馏水至1 L，灭菌锅灭菌备用，固体培养基加琼脂粉（Agar），比例为1.5%。（3）0.3%半固体培养基（pH=7.0，蒸馏水定容至1 L）：细菌专用运动性蛋白胨0.3 g、酵母提取物0.3 g、琼脂粉3 g;加入蒸馏水至1 L，在121 ℃灭菌锅高温高压灭菌备用。

1.2 方法 试验于2019年3—12月在中国农业科学院植物保护研究所实验室进行。

1.2.1 西瓜噬酸菌LuxR家族蛋白AryR同源性和结构域分析 利用BLASTp工具及SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分别对蛋白的注释信息及结构域进行分析。

1.2.2 突变株ΔaryR及互补菌株ΔaryRcomp的筛选及验证 利用Primer 5.0软件根据目的基因aryR左右两端设计引物并扩增目的基因的上下游片段，设计片段引物对LaryR-F/LaryR-R和RaryR-F/ RaryR-R，以西瓜噬酸菌Aac-5基因组为模板，扩增目的片段上游和下游片段。通过连接酶将扩增片段与庆大基因（Gm）连接于酶切过后的pK18mobsacB中，构建重组质粒pK18-aryRGm。采用三亲交配的方法将重组质粒导入野生型Aac-5的菌株中。因为质粒pK18mobsacB中蔗糖致死基因的缘故，重组质粒无法在含有蔗糖的培养基上生长。因此在含有抗生素加10%蔗糖的KB平板上，理论上可筛选得到突变株。大量挑取平板中生长的单菌落进行验证，采用果斑病原菌的特异性引物WFB1/WFB2[19]及目的基因的特异性检测引物aryRF/aryRR进行PCR验证。PCR扩增引物序列、酶切位点见表1。

利用pBBR1MCS-2质粒来构建互补菌株，设计目的基因的互补片段引物pBBRaryR-F/pBBRaryR-R，扩增aryR基因的片段。基因片段为1 023 bp。扩增片段与质粒连接后导入突变株中，由于pBBR1MCS-2载体含有卡那抗性，所以在抗性平板中理论上长出的单菌落即为互补菌株，利用载体的通用引物进行验证获得正确菌株。

1.2.3 致病性测定 采用喷雾接种的方法[20]。用KB液体配体培养基28 ℃培养野生型Aac-5菌株、突变菌株ΔaryR及互补菌株ΔaryRcomp将菌株培养至对数生长期，收集菌体后用无菌水重复悬洗3次将培养基液体洗净，加无菌水将菌悬液OD600调至0.3收集200 mL，菌悬液采用喷雾接种的方法均匀喷至2叶1心期的西瓜幼苗，无菌水喷雾作阴性对照，在温度为28 ℃相對湿度为90%的光照培养箱中培养8 d之后进行病情指数调查[21]。每个处理3盆苗，3次重复。

1.2.4 致敏性测定 KB液体培养基加抗生素28 ℃摇野生型菌株Aac-5、突变菌株ΔaryR和互补菌株ΔaryRcomp至对数期，然后离心，对菌体进行收集，无菌水重悬菌体至OD600=0.3。使用1 mL注射器（去掉针头）取适量菌液，在幼嫩烟草叶背面（轻轻但是要尽量充满注射部位）注射于叶脉与叶脉之间相交的地方，阴性对照为无菌水;在28 ℃光照培养箱中进行培养，1 d后观测供试菌株的致敏性发生情况，3次重复。

1.2.5 运动性测定 野生型Aac-5菌株、突变菌株ΔaryR及互补菌株ΔaryRcomp供试菌株28 ℃培养收集菌体后无菌水调菌悬液至OD600=0.3取5 μL菌悬液点至专供测定菌株运动能力所用的运动性半固体培养基，轻点且点至培养基中央，培养皿正面朝上放至28 ℃的培养箱中培养3 d，每个处理进行9次生物学重复，试验进行3次重复。对平皿中晕圈直径进行测量拍照并进行统计学分析[21]。

1.2.6 蹭行运动测定 将野生型Aac-5菌株、突变菌株ΔaryR及互补菌株ΔaryRcomp供试菌株在含有抗性（ApR）的平板上进行培养，培养3 d后观察类似于波纹状的痕迹是否在单个菌落周围形成。

1.2.7 生物膜形成能力测定 将野生型Aac-5菌株、突变株ΔaryR及互补菌株ΔaryRcomp单菌落在KB液体培养基摇至对数期，在灭菌三角瓶中加入30～50 mL菌液。28 ℃培养箱中静止培养7 d，将菌液倒出，加入0.1%的结晶紫溶液进行染色，时间持续1 h左右。将染色后的三角瓶用蒸馏水冲洗多次，之后将三角瓶放入烘箱80 ℃烘干1 h之后进行拍照，适量无水乙醇进行洗脱，测定其在OD575下的吸光度，每个处理3个生物学重复，试验进行3次重复。

1.2.8 相关基因表达分析 将野生型Aac-5菌株和突变株菌株ΔaryR的总RNA进行提取并进行反转录，反转录的cDNA浓度统一调至60 ng?μL-1，进行荧光定量检测（qRT-PCR检测）。选取rpoB作为内参基因[22]。

2 结果与分析

2.1 西瓜噬酸菌LuxR家族蛋白AryR的结构为Lux_C

蛋白AryR的结构为Lux_C， 其氨基端没有任何典型的结构域，羧基端为典型的HTH结构域。AryR为典型的LuxR家族调控因子（图1）。

2.2 ΔaryR及互补菌株的制备及验证

突变株的筛选采用三亲交配的方法与同源重组双交换的原理，将连接成功的重组质粒pK18-LaryRL-Gm-RaryRR通过三亲交配的方法转入野生型Aac-5中，经一系列检测可获得试验所需突变菌株。由于突变株中被插入了Gm基因，所以可在含有庆大霉素抗性（GmR） 的培养基中进行单菌落的生长，但是果斑病病原菌是不含有此抗性的，所以可通过此种方法筛选得到突变株。Gm基因比aryR基因要短200 bp左右，检测片段与华大测序结果均与预期一致，由此可证明获得突变株（图2～3）。

扩增目的基因互补片段，片段与pBBR1MCS-2载体进行连接构建成功的重组质粒通过三亲交配的方法导入已经构建好的突变株中，经PCR和测序验证符合预期结果，由此可证明成功获得互补菌株（图4）。

2.3 aryR基因缺失导致西瓜噬酸菌Aac-5菌株致病力下降

观察喷雾接种8 d之后的西瓜幼苗发病情况。统计之后得出结果，无菌水作为阴性对照（CK），野生型Aac-5菌株、突变株ΔaryR、互补菌株 ΔaryRcomp的病情指数分别为48.32、34.74、45.28，突变株致病性未丧失但致病力有所下降，互补菌株的致病力基本恢复（图 5）。

2.4 aryR基因缺失未导致西瓜噬酸菌Aac-5菌株丧失在非寄主烟草上的致敏性

三生烟草（Nicotiana tabacum）幼苗中注射野生型Aac-5、突变株ΔaryR及互补菌株ΔaryRcomp菌悬液，无菌水作为阴性对照（CK），24 h后观察结果发现：对非寄主烟草仍具有致敏性，与Aac-5野生型菌株无差异（图6）。

2.5 aryR基因缺失导致西瓜噬酸菌Aac-5菌株运动能力降低

36 h后对试验结果进行记录测量和拍照，结果得出，野生型 Aac-5、突变株菌株ΔaryR、互补菌株ΔaryRcomp运动直径分别为 2.97、2.62、2.93 cm 。由此可知，aryR基因缺失导致Aac-5菌株运动能力降低，互补菌株的运动能力基本恢复（图7）。

2.6 aryR基因缺失导致西瓜噬酸菌Aac-5菌株蹭行运动能力丧失

供试菌株在平板上的生长状况显示：野生型Aac-5菌株及互补菌株ΔaryRcomp可以在平板培养的单菌落四周形成水波纹状的运动轨迹，突变株ΔaryR则丧失此蹭行能力（图8）。

2.7 aryR基因缺失导致西瓜噬酸菌Aac-5菌株生物膜形成能力提高

相比较于野生型菌株，突变株ΔaryR的生物膜形成能力增强，OD575 的吸光值为2.10。互补菌株ΔaryRcomp与野生型Aac-5菌株相比，恢复了其生物膜形成能力（图9）。

2.8 aryR基因缺失导致hrpE、hrcN、fliR、fliC基因表达量下调

采用qRT-PCR方法，对突变菌株中T3SS功能基因hrpE、hrcN及鞭毛基因fliR、fliC的表达情况进行了进一步的检测。把野生菌株的表达作为标准设为1，结果表明，突变菌株中T3SS功能基因hrpE和hrcN表达值分别为0.14和0.40，鞭毛相关基因fliR和fliC表达值分别为0.89和0.90，表达量下调，与野生型菌株相比，存在极显著差异（图10）。说明aryR基因对hrpE、hrcN、fliR、fliC为正调控。

3 讨论与结论

许多病原菌利用LuxR调控因子調节细菌各种行为相关的功能基因的表达[23]。西瓜噬酸菌中AryR具有典型的LuxR家族调控因子结构特征。笔者通过同源重组方法获得了aryR基因全缺失的突变株，经过对致病性、运动性、生物膜形成能力等表型的分析发现其致病力等表型发生变化，互补菌株的表型有所恢复，说明了aryR 基因对果斑病病原菌的致病性、运动性包括运动能力和蹭行运动能力、生物膜形成能力具有重要的影响。蛋白AryR的氨基端无明显的结构域，通过亲缘关系分析结果发现，其与Xoo的蛋白OryR分在一簇，亲缘关系最近，因此西瓜噬酸菌LuxR家族功能蛋白AryR是否也能如蛋白OryR一样通过接收寄主植物上的小分子信号物质来行使功能需要进一步的试验证明。

III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）是植物病原细菌致病过程中的关键因子[24]。本实验室前期研究证明，III型分泌系统hrcQ缺失导致Aac-5菌株对寄主的致病能力丧失，运动性及生物膜形成能力降低，并丧失了引起烟草过敏性反应能力[25]，hrcN缺失导致喷雾接种的菌株致病力丧失[26]。hrcC基因的缺失使得突变菌株丧失了致敏性及致病力[27]。hrcR基因缺失后菌株的致病力也完全丧失[28];hpaA和hrpG基因突变体的鞭毛缺失且细胞形态发生显著变化[29]。在T3SS中hrpE、hrcN基因分别起到针管运输和提供能量的作用[30-31]，通过qRT-PCR测定了西瓜噬酸菌中III 型分泌系统功能基因 hrpE及hrcN的表达情况，发现aryR基因的缺失引起了西瓜噬酸菌Aac-5菌株III型分泌系统功能基因的表达量显著下调，由此推测aryR基因对hrpE和hrcN具有正调控作用。aryR基因的缺失导致hrpE和hrcN的表达量下调，相应的针管结构与提供能量的功能受到影响，因此III型分泌系统效应子分泌时受到影响，可能是突变株致病力下降的原因之一。笔者证实西瓜噬酸菌中aryR缺失后，病原菌在非寄主烟草中引起过敏性反应的能力并未丧失，这说明aryR可能并非是西瓜噬酸菌在非寄主烟草上诱导过敏反应（HR）的关键基因之一。

鞭毛在植物病原细菌的致病机制和定殖中起重要作用[32]，通过测定鞭毛功能基因fliR及fliC在野生型Aac-5菌株和突变株中的表达量，发现基因aryR的缺失引起fliR基因及fliC基因的表达量下调，病原菌运动能力下降。因此推测，运动能力的下降是引起突变株ΔaryR致病力下降的原因之一。

本研究中Aac-5野生型菌株为西瓜噬酸菌中的II组菌株，此菌株在玻璃和塑料表面均不能形成明显的生物膜[33]。突变株ΔaryR的生物膜形成能力明显高于野生菌株。细菌中能增强附着能力的表面附属物，例如鞭毛，与生物膜的形成有关[34-36]。蹭行运动与生物膜的形成密切相关，已在铜绿假单胞菌中得到证实[37]。本研究中，Aac-5缺失aryR基因后，运动能力明显降低，蹭行运动能力缺失。因此推测，运动能力下降和蹭行运动能力的缺失是突变株生物膜形成能力增强的主要原因之一。

笔者对调控因子aryR 的基因功能仅做了初步探索，表明了调控因子aryR在果斑病病原菌——西瓜噬酸菌中具有重要的调控作用，对西瓜噬酸菌的致病机制做了初步研究。但该调控因子是否与水稻白叶枯病菌中OryR一样可以与寄主植物互作需要进一步深入研究。

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