青春期DEHP暴露对成年大鼠神经行为的影响

杨 媛，周鑫蓓，刘宛书，金会艳

(昆明医科大学 基础医学院，云南 昆明 650500)

邻苯二甲酸二乙基己酯(Di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP) 是目前用量较大的邻苯二甲酸酯类化合物(PAE)的重要成员，主要应用于各种塑料产品如纤维素树脂、聚乙烯和聚氯乙烯食品包装材料，医用材料和儿童玩具的生产加工[1]。由于在塑膜加工过程中，DEHP并未与PVC塑膜以共价化学键结合，因此，随着时间的推移，它很容易从塑料中转移至外环境，从而污染空气、水体、以及土壤[1]。由于其产量巨大并且可以通过进食、饮水、呼吸以及皮肤接触进入人体，因此，目前其生理学毒性备受全球环境医学研究者关注[2]。

DEHP是一种公认的环境内分泌干扰物质，具有拟雌激素、抗雄激素活性的性质，可干扰人体内源性激素的分泌，因而对人和动物产生多方面不利影响，其中研究广泛是其生殖发育毒性[3]。近年来的研究显示暴露在DEHP环境中对神经系统也有一定的毒害作用。DEHP暴露引起神经管畸形、露脑畸形和通过芳香化酶影响神经系统的功能[4]。虽然DEHP对于动物认知行为的影响已经被人们初步认识，但是对其研究多集中于妊娠期和围产期DEHP暴露对子鼠认知行为的影响[5]，而青春期DEHP暴露对大鼠神经行为的影响的研究较少,且研究结果也不一致。王冬的研究发现，青春前期暴露于DEHP的雄性大鼠产生焦虑样和抑郁样行为[6]。DEHP暴露还可损伤青春期雄鼠的空间学习记忆能力[4]。因此，本实验探讨了青春期暴露于不同剂量DEHP对成年大鼠神经行为的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

出生后21 d的SD雄性大鼠，24只，由昆明医科大学实验动物学部提供。整个实验过程中动物自由进食进水，室内温度 23～25℃，相对湿度60%～70%，维持12 h光照/12 h黑暗的昼夜节律，实验符合相关伦理学要求。

1.2 仪器

动物行为学视频跟踪系统(Smart 3.0，西班牙)，红外视频恐惧系统(MED associates，美国)。

1.3 实验方法

幼鼠随机分为3组：溶剂对照组(玉米油)，中浓度组(50 mg/kg)，高浓度组(500 mg/kg)，每组各8只。连续2周对幼鼠进行灌胃处理，达到8周龄后进行行为学测试。

1.3.1 开放场实验

行为学实验前，提前将大鼠放入实验室中适应2 h。开放场尺寸为40 cm×40 cm×35 cm(长×宽×高)的箱子，让大鼠在箱内自由运动6 min，分析后5 min内的自发活动。

1.3.2 高架十字迷宫实验

实验时将大鼠头朝开臂放入迷宫中央区，同时开启摄像记录下大鼠5 min内进入开臂次数及进入开臂的时间。

1.3.3 强迫游泳测试

大鼠放入透明玻璃圆缸中，温度控制在25℃。第一天将大鼠放入水中训练15 min，拿出大鼠用毛巾擦干后放回鼠笼。第二天同样的条件下游泳6 min，记录6 min中内后5 min大鼠不动的时间。判断不动是指大鼠基本不做主动的活动，仅在必要的时候用后肢碰触底面避免窒息。

1.3.4 背景条件恐惧实验

实验在特定的操作箱内进行(MED associates,St,Albans,VT)。第一天进行背景条件化恐惧记忆的训练，将大鼠放在操作箱内，让其自由探索2 min，然后给与5 次足部电击，电击间隔时间为2 min，每次电击的强度为0.8 mA，持续时间为2 s。最后一次电击结束后2 min将大鼠拿回饲养笼。记录训练过程中大鼠每次电击后2 min内的僵立时间，判定标准为除了呼吸和缓慢的钟摆式动作其他所有动作停止并持续2 s以上。24 h后，进行背景条件恐惧记忆的提取，大鼠放回恐惧训练箱中，不给足部电击，记录大鼠在4 min内的僵立时间。

1.4 统计学方法

实验结果以均值±标准误(Mean±SEM)表示。恐惧记忆测试的数据用重复测量双因素方差分析(repeated measure two-way ANOVA)进行检验。其余数据用Student's T-test 进行检验，统计分析采用SPSS 19，当P<0.05 认为有显著差异。

2 结果

2.1 青春期DEHP暴露对成年大鼠焦虑样行为的影响

首先在开放场中测试动物在新颖环境中的探索和活动性。如图1所示,青春期DEHP暴露，中浓度组(50 mg/kg)和高浓度组(500 mg/kg)在开放场中的总的活动距离(Distance moved)与对照组相比有所增加，但无显著性差异(P >0.05)，表明青春期DEHP暴露对成年大鼠的活动性没有明显影响。

(均值±标准误，*P < 0.05，与正常对照组比较)

如图2所示，在高架十字迷宫测试中，青春期DEHP暴露，中浓度组(50 mg/kg)和高浓度组(500 mg/kg)大鼠在开臂的时间(Time spent in open arms)和开臂的总次数(Entries in open arms)与正常对照组相比，差异均无显著性(P>0.05)。

(均值±标准误，*P < 0.05，与正常对照组比较)

图2 青春期DEHP暴露对高架十字迷宫实验的影响

2.2 青春期DEHP暴露对大鼠强迫游泳实验的影响

(均值±标准误，*P < 0.05，与正常对照组比较)

如图3所示，青春期 DEHP暴露中浓度组(50 mg/kg)与正常对照组比较强迫游泳不动时间(Immobility time)有所缩短，但无显著性差异(P>0.05)。高浓度组(500 mg/kg)与正常对照组比较强迫游泳不动时间缩短，有显著差异(P <0.05)。表明青春期DEHP暴露影响成年大鼠在强迫游泳实验中的活动性。

2.3 青春期DEHP暴露对大鼠背景条件恐惧实验的影响

如图4所示，青春期DEHP暴露，中浓度组(50 mg/kg)和高浓度组(500 mg/kg)及正常对照组都表现出较好的习得背景环境依赖的恐惧，随着训练的进行表现出不断增强的恐惧行为，但没有明显的组间效应(P >0.05)，说明DEHP暴露和正常对照组相比，背景条件化恐惧记忆的学习没有差异。

(均值±标准误，*P < 0.05，与正常对照组比较)

图4 青春期DEHP暴露对大鼠恐惧记忆的影响

第二天提取，DEHP暴露中浓度组(50 mg/kg)与正常对照组比较僵立时间(Freezing %)无明显变化(P>0.05)，但高浓度组(500 mg/kg)与正常对照组比较僵立时间缩短(P <0.05)。表明青春期DEHP暴露影响成年大鼠在背景条件恐惧记忆的提取。

3 讨论

青春期是脑发育和动物神经行为形成的又一个关键时期，此时脑内的性激素水平对行为性别分化起关键作用。因此，在此时期极易受到内分泌干扰物DEHP的影响。目前对青春期DEHP暴露对大鼠神经行为的影响的研究较少，且研究结果也不一致。本研究通过几种行为学实验检测了青春期DEHP暴露对成年大鼠多种行为的影响，发现DEHP暴露不影响大鼠的活动性和焦虑样行为，但高浓度DEHP暴露影响大鼠在强迫游泳中的活动性。同时高浓度DEHP暴露损伤了大鼠背景条件恐惧记忆。