星点设计法优化玛咖中总黄酮的提取工艺

郭雅丽，王 易，张 邈，程玉蕾，张德娥，李佳艺，肖 莉

(湖州师范学院 生命科学学院，浙江 湖州 313000)

玛咖有“秘鲁人参”之称，是一种传统的药食两用型植物，目前在我国云南地区广泛种植[1]。临床药理研究结果显示，玛咖富含生物碱、玛咖酰胺、玛咖烯、黄酮、多糖等次生代谢产物，具有改善性功能、抗疲劳、抗氧化等功效，药用价值较高，受到人们的广泛关注[2-4]。目前对玛咖中活性成分的研究主要集中于玛咖酰胺、玛咖烯及多糖等，对玛咖中黄酮成分的研究则较少。本研究以玛咖总黄酮为指标，在单因素实验的基础上，利用星点设计-响应面优化法对超声波辅助提取玛咖总黄酮的提取工艺进行优化，为玛咖总黄酮源的综合利用提供参考[5-6]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子分析天平，Mettler Tlledo；756CRT紫外可见分光光度计，上海佑科；高速多功能粉碎机，上海舍岩；旋转蒸发仪，上海亚荣；抽滤真空泵，郑州长城；超声波清洗器，上海阁凌。

1.2 试药

玛咖原粉，产自云南，晒干后加工为玛咖粉；芦丁标准品，中国药品生物制品检定所，批号：F20171108；无水乙醇、95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等，均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 玛咖总黄酮的测定

2.1.1 标准储备液的配制

精密称取一定量的芦丁对照品置于50 mL容量瓶中，加入适量95%乙醇超声处理使溶解后，续加95%乙醇稀释定容至刻度，摇匀，得到0.200 mg/mL的标准储备液备用。

2.1.2 标准曲线的绘制

分别精密吸取标准储备液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL置于10 mL容量瓶中，依据显色条件依次加入亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液、氢氧化钠溶液，并在510 nm波长处依次测定吸光度，得到线性回归方程为：A=5.0378C-0.011，R2= 0.9968，表明在0.04～0.14 mg/mL范围内，吸光度与浓度线性关系良好。

2.1.3 总黄酮含量的测定

精密吸取一定量的玛咖提取液，按2.1.3项方法测定吸光度，代入回归方程，计算得到玛咖总黄酮含量，根据下述公式，计算得玛咖总黄酮提取率。

C为提取液中玛咖总黄酮浓度(mg/mL)，V为提取液体积(mL)，M为玛咖药材粉末投料量(g)。

2.2 单因素考察

2.2.1 乙醇浓度

精密称取玛咖粉末10.00 g，固定料液比为1∶7，超声时间为30 min，考察在40%、50%、60%、70%、80%乙醇浓度条件下总黄酮的提取率。

2.2.2 料液比

密称取玛咖粉10.00 g，固定乙醇浓度为60%，超声时间30 min，分别考察在料液比(g/mL) 为1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13的条件下总黄酮的提取率。

2.2.3 提取次数

密称取玛咖粉末10.00 g，固定乙醇浓度为60%，料液比为1∶7，超声时间为30 min，考察提取次数为1次、2次、3次时总黄酮的提取率。

2.2.4 提取时间

精密称取玛咖粉末10.00 g，固定乙醇浓度为60%，料液比为1∶7，考察分别在超声时间10、20、30、40、50 min 条件下总黄酮的提取率。

2.3 响应面优化提取工艺

单因素试验的结果，只能得到单因素对提取率的影响，无法获得单因素之间的交互作用结果。本实验在单因素实验的基础上，根据星点设计原理，选择乙醇浓度(A)、料液比(B)及提取时间(C)3个影响因素为自变量，以玛咖总黄酮提取率为响应值，设计3因素5水平响应面分析方法优化提取工艺，采用Design-Expert v8.0进行试验结果分析。因素水平表见表1。

表1 响应面因素水平表

3 实验结果与讨论

3.1 单因素实验结果

图1 乙醇浓度、料液比、提取时间及提取次数对玛咖总黄酮提取率的影响

Fig.1 Effect of ethanol,material-liquid ratio,extraction time,frequency on extraction rate of flavonoids from Maca

单因素实验结果如图1所示。由图可知，当乙醇浓度为60%时测得玛咖总黄酮提取率最高，这可能是由于玛咖黄酮中主要成分为中等极性的黄酮苷类物质，随着提取溶剂中乙醇体积分数的增加，体系的极性下降，从而降低了黄酮苷类物质的溶出。随着超声时间的延长，玛咖总黄酮的提取率出现先增加后降低的趋势，当超声时间为30 min时，玛咖总黄酮提取率达到最高值0.58%。这是由于随着超声时间的延长，玛咖总黄酮逐渐达到溶出平衡，超过30 min时，玛咖中杂质成分的溶出也随之增加，从而干扰玛咖总黄酮的测定。当料液比达到1∶7时，玛咖总黄酮提取率达到最高值。究其原因，可能是由于此时玛咖中的黄酮成分已基本溶出完全，进一步提高料液比也无法提高提取率，从而造成溶剂的浪费。玛咖总黄酮提取率虽然随提取次数的增加有所升高，但升高并不明显，从实验效果与成本等多方面考虑，因此确定最佳提取次数为1次。根据单因素实验结果，确定后续响应面优化的各自变量范围为：乙醇浓度50%～70%，超声时间20～40 min，料液比1∶5～1∶9。

3.2 响应面优化提取工艺结果

采用星点设计原理设计玛咖总黄酮提取实验安排及实验结果见表2。

表2 星点实验设计及结果

以玛咖总黄酮提取率为指标(R1)，采用Design-expert8.0.6软件对响应值与各因素进行回归拟合，得到的回归方程为：

R1=0.98-0.13A-0.056B+0.028C+0.051AB-0.026AC+0.011BC-0.19A2-0.082B2-0.19C2

表3 回归模型方差分析

注: *P<0.05;＊＊P<0.01;＊＊＊P<0.001

3.3 交互作用对玛咖总黄酮提取率的影响

相对于三个单因素其中两个因素，通过Design-expert软件绘制三维响应面图，进一步分析各因素交互作用对玛咖总黄酮提取率的影响。响应面的平缓程度，直观地反映了各自变量发生变化时玛咖总黄酮提取率的响应灵敏程度。

图2 两因素交互作用对玛咖总黄酮提取率影响的响应面图

图2中的三维效应面图可以反映出乙醇浓度(A)、提取时间(B)和溶剂倍数(C)的交互作用对玛咖总黄酮提取率的影响。AB、AC、BC的曲面坡度均较为平缓，故其对玛咖总黄酮提取率的影响不显著，与方差分析的结果一致。

3.4 最优方案的验证

设置玛咖总黄酮提取率目标值为最大值，通过Design-Expert 软件分析出最佳提取工艺为：乙醇浓度57.58%，提取时间27.35 min，料液比1∶7.10，60℃下提取1次，玛咖总黄酮理论提取率为1.01%。按此工艺平行实验三次，得到的玛卡总黄酮平均提取率为0.99%，实测值与预测值差别不大，说明该工艺稳定可靠。

4 结论

本研究采用星点设计-效应面优化法，可以直观反映出各个因素对玛咖总黄酮提取率的影响。二项式拟合结果显示相关系数R为0.9763，说明本次建立的拟合模型较为成功，预测性良好。获得最佳提取条件为：乙醇浓度57.58%，提取时间27.35 min，料液比1∶7.10，60℃下提取1次，在此条件下玛咖总黄酮提取率为0.99%，为玛卡总黄酮的提取应用提供一定的参考。