环境胞外胞内DNA的行为归趋及生态功能研究进展

张忠云，叶茂，孙明明，黄丹，张胜田，胡锋，蒋新

1. 中国科学院南京土壤研究所，中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室，南京 210008 2. 中国科学院大学，北京 100049 3. 南京农业大学，资源与环境科学学院土壤生态实验室，南京 210095 4. 生态环境部南京环境科学研究所，土壤污染防治研究中心，南京 210042

DNA是一种特殊形式的环境有机质组分，是生命所有分支中遗传信息的通用存储材料，存在于细胞内和细胞外。存在于活细胞外的DNA被称为细胞外DNA(extracellular DNA, extDNA)，是水生和陆生生态系统中丰富的生物聚合物；存留在代谢正常活细胞内的DNA则被称作细胞内DNA(intracellular DNA, intDNA)。extDNA分子大多与活细胞释放和死亡细胞有关，存在于土壤、水体、沉积物和沙漠等大部分环境中，易参与吸附、降解和自然转化等环境过程，也可参与微生物基因传递；同时，extDNA也是细菌生物膜中一种重要的组成成分，参与生物膜形成初期基质粘附及细菌聚集过程，形成后的生物膜对抗生素、重金属和有机污染物等化合物毒性具有一定抵御作用。intDNA分子通常存在于活细胞内，参与生物体内细胞自然代谢、水平及垂直基因转移等过程；同时，微生物细胞释放intDNA是环境extDNA的主要来源之一。本文将从ext/intDNA在环境中的留存及其土壤环境行为、extDNA在模式菌株生物膜形成中的作用及ext/intDNA在基因信息传递过程中的角色等角度，综述ext/intDNA物理、化学环境行为及其各自携带的生物信息差别。本综述可为进一步探明环境中ext/intDNAs生态功能的交互作用过程与机制提供科学参考。

1 extDNA和intDNA环境存留及其行为归趋(Environmental retention and fate of extDNA and intDNA)

1.1 extDNA和intDNA

死亡细胞裂解和活细胞分泌通常会产生extDNA，细胞自溶、病毒侵染和主动转运等都是extDNA产生的主要途径[1-6](图1)。环境中extDNA包含：游离态、松散和紧实结合态extDNA[7-8]。细菌可利用游离态extDNA作为C、N、P和O等基本元素的能源[2,9-10]，也可整合同源或异源extDNA进入染色体，使其成为自身DNA的一部分或将其作为自身生物膜的一种组分[11-12]。松散及紧实结合态extDNA通过磷酸基团间的无机阳离子桥或二价阳离子与有机质结合，一般以吸附或结合态存留于环境中，不易被核酸酶攻击，较为稳定[13-14]，但随着环境pH、温度和矿物性质等因素的变化，这部分extDNA也可以逐渐参与解吸和降解等物质循环过程[2,15-16]。extDNA中包含有大量来自细胞死亡后裂解产生的DNA。据统计，全球海洋沉积物中约有0.3×109～0.45×109t extDNA，是同一环境下活细胞总DNA的70%以上[17-18]。

intDNA是存留在正常代谢细胞内的DNA(图1)，活细胞主动分泌、细胞裂解和重金属/有机污染物胁迫下细胞被动分泌等都是intDNA转化为extDNA的方式[19]。大多intDNA正常参与生态系统中元素循环及生物体代谢，是微生物活细胞间水平及垂直基因转移的主力军，且大多intDNA存在于活细胞内，不会被土壤及沉积物颗粒吸附，与extDNA环境行为及生态功能作用机制一般不同[20-22]。

传统过滤及离心方法通常只能提取<10%总extDNA，目前常用的extDNA提取方法，如醇沉法、十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)萃取法、DNA萃取试剂盒等通常适用于沉积物、污泥、生物膜及含有丰富的extDNA的土壤中extDNA提取，对于DNA含量较低的水体环境却不太适用[8,13,23-25]。目前对于ext/intDNA的研究大多致力于将extDNA和intDNA精准分离，探讨extDNA的环境行为、extDNA在微生物群落多样性估算中的比重、extDNA和intDNA分别对物质循环和基因传递各自的贡献机制等。

图1 环境胞内/胞外DNA及其环境行为Fig. 1 Environmental behaviors of extracellular DNA and intracellular DNA

1.2 extDNA和intDNA的环境相对丰度

extDNA和intDNA在不同环境体系中普遍存在。通常条件下，土壤及沉积物环境中extDNA丰度较intDNA高，水体中intDNA丰度较高；土壤及沉积物中extDNA丰度比水体中extDNA丰度高[26]。据统计，extDNA在沉积物中的浓度是水体中浓度的3倍～4倍[27]，沉积物中extDNA的半衰期也比在水体系中长，这可能与沉积物的特殊环境及沉积物对extDNA的吸附等作用有关[28-30]。土壤中也含有丰富的extDNA且多集中在土壤表层[31]。Lennon等[18]使用DNA酶(DNase)去除土壤样品中的extDNA，发现extDNA约占据土壤总DNA的0%～83%；Carini等[32]使用叠氮溴化丙锭去除土壤中的extDNA，发现这部分DNA约占据土壤总DNA的40%；不同的比例可能与extDNA去除方法及土壤性质等环境因素密切相关[33]。去除方法若不足以消除土壤有机质、pH、阳离子类型与浓度等土壤性质对DNA吸附的影响，则去除方法并不能将吸附态extDNA全部去除，吸附态extDNA的存在降低了可提取态extDNA的有效性，从而减少可估计的extDNA比例[32]。目前文献中已有的不同环境体系中ext/intDNA的检出浓度如表1所示。

由表1可知，不同环境体系中ext/intDNA检出浓度并不相同，土壤和沉积物是ext/intDNA重要的储库；目前能够得到的土壤中extDNA浓度范围在0.0047～41.1 μg·g-1，深海沉积物上层达到119.1 μg·g-1；不同的环境体系中，intDNA检出范围在0.8～2 047.4 μg·g-1。

1.3 extDNA和intDNA的环境归趋

ext/intDNA在土壤环境中的归趋，决定于ext/intDNA和土壤环境体系的生物和物理特性。目前，关于ext/intDNA在土壤中的环境行为研究主要集中于ext/intDNA在土壤中的吸附、降解代谢及基因传递等。extDNA不被细胞膜保护，在土壤环境中可游离存在，也可与土壤矿物质及腐殖质相结合。游离态及结合态extDNA都可以作为植物与微生物生长的营养来源，同时还能成为细菌生长时的基因组来源。intDNA被细胞膜包被，在土壤中的环境行为更多依赖于动物、微生物摄食作用及intDNA向extDNA的转化过程。

1.3.1 吸附

细胞裂解后产生的extDNA易被环境中大量存在的核酸酶攻击，破碎成为小分子extDNA，被砂砾、矿物吸附或通过与有机质结合后免受核酸酶攻击[2,45]；据统计，>80%的海洋沉积物中DNA为extDNA，且>95% extDNA被沉积物所吸附，只有少于5%为游离态extDNA[2,17,19]。土壤中extDNA被土壤矿物质、腐殖质及有机质吸附，得以免受微生物DNA酶的快速降解作用[46]。Blum等[47]研究发现，在砂土及沙壤土中添加300 ng3H标记的外源extDNA，通过探究吸附位点有效性发现，extDNA进入土壤1 h后即达到吸附最大值，80% extDNA都被吸附；土壤吸附位点保护extDNA免受DNA酶攻击可能是在土壤颗粒的吸附作用下，削弱了DNA酶与extDNA直接反应的能力和概率[48]。但是，也有相关研究表明，若DNA酶饱和占据与吸附态extDNA相邻的土壤矿物吸附位点，则这部分extDNA依旧会被DNA酶降解[46]。

土壤矿物组成、土壤pH、腐殖质含量和阳离子含量等因素都会交互影响土壤中extDNA的吸附过程。土壤矿物成分和阳离子含量对extDNA的吸附和结合量差异较大[49-50]。Hou等[51]探究游离态鲑鱼精子DNA在3种原始粘土(辉长岩、蒙脱石和绢云母)上的吸附规律，发现DNA吸附量大小顺序为辉长岩>蒙脱石>绢云母；pH=7.0时向体系中分别加入无机离子Na+、Mg2+和Al3+，发现Al3+体系中，DNA吸附量增加最明显，这可能的原因是当pH=7.0时，粘土矿物表面为负电荷表面，高价阳离子更易与负电荷DNA分子和负电荷矿物表面以阳离子桥相结合；Franchi等[52]将吸附体系中的Na+替换成Mg2+和Al3+，发现蒙脱石、高岭石和针铁矿中DNA吸附量明显上升，这说明粘土矿物中高价阳离子吸附带负电荷DNA效果更显著。不同土壤pH也会影响土壤中extDNA吸附量。Cai等[53]使用鲑鱼精子DNA探究其在褐土和粘土矿物等4种不同胶体上的吸附和解吸，发现体系pH由2.0升至5.0时，有机粘土及蒙脱石上吸附extDNA量显著减少，pH高于5.0时，有机粘土上吸附的extDNA可忽略不计；在无机矿物和高岭石上，pH由2.0升至9.0时，extDNA吸附量缓慢减少，这说明有机矿物和蒙脱石中静电相互作用对extDNA吸附影响较大。但是有学者提出，已有的extDNA吸附试验一般人为控制矿物粒径大小和粘土颗粒表面电荷，这种处理会使DNA吸附量增加，试验中的土壤体系与实际环境并不相同[54]；Gardner和Gunsch[54]使用不经过表面修饰的模式牛胸腺extDNA和转基因玉米extDNA，探究其在高岭石、蒙脱石及3种土壤混合物(砂壤土、粘土和粉砂壤土)中的吸附，实验结果表明，纯蒙脱石和高岭石吸附能力比和Demanèche[46]等和Khanna等[50]报道过的吸附能力低1至2个数量级，但是吸附量仍然可以达到200 mg·g-1(粘土)DNA；粘土含量较高的土壤往往可以吸附更多量的游离态extDNA。因而，粘土颗粒可能是外源微生物重要的游离态extDNA来源。

表1 不同环境体系中细胞外和细胞内DNA(ext/intDNA)相对丰度Table 1 Relative abundances of extracellular and intracellular DNA (ext/intDNA) in different environments

1.3.2 降解

extDNA进入土壤环境中，DNA自身性质和土壤环境因素都会对extDNA降解产生影响[28,46]；DNA自身性质包括DNA来源、DNA中G+C碱基含量、分子纯度以及分子重量。土壤环境因素包括土壤矿物组成、有机质含量、温度、静电作用和土壤湿度等。Sirois和Buckley[55]将人工合成的变形链球菌extDNA施加进入土壤，探究了土壤湿度、温度、农业管理措施和栖息地类型等因素对土壤环境中extDNA降解动力学的影响。研究结果表明，extDNA在土壤中迅速降解，extDNA降解速率与湿度及温度呈正相关，与土壤有机质含量呈负相关；extDNA在耕种土壤中比在休耕土壤中有更高的降解率和更低的固定率，只有极少部分extDNA能够在土壤中相对持久存在。

在不同的环境介质中，extDNA的降解速率并不相同。Dell’Anno和Corinaldesi[26]探究在海洋水体及沉积物中游离态extDNA的降解及转化率，发现沉积物中extDNA降解速率较快，是水体中的7倍～100倍，这与沉积物中含大量DNA酶有关；同时，由于沉积物中extDNA样品含量较多，约为水体中含量的4.3倍，不平衡的含量供应-降解率使得沉积物中extDNA的转化率比水体中extDNA的转化率低得多，因而半衰期更长，沉积物中extDNA半衰期29～93 d不等，而水体中只有10 h左右。

Torti等[23]采集丹麦奥胡斯湾中约海底以下10 m沉积物，分离样品中的extDNA和intDNA，发现，近半数DNA都为extDNA；同时，实验中还探究了>600碱基对(bp)的高分子量extDNA和<600 bp的低分子量extDNA占据的比例，发现随着沉积物深度增加，小分子量extDNA含量由占总extDNA的15%上升至40%，这说明沉积物深度增加，extDNA降解量增加。这可能因为即使在生物活性较低的深层沉积物中，DNA酶含量依旧很高。同时，Gulden等[56]探究了温度对DNA降解动力学产生的影响，发现土壤下渗液中extDNA半衰期随着温度上升而缩短，这说明DNA降解也是一个基于反应速率的酶促反应。Henriksen和Breland[57]发现当环境温度低于0 ℃时，依旧可以检测到显著的微生物活性，DNA依旧会缓慢降解；这可能是尽管DNA酶促反应减少，但是化学水解、化学氧化和DNA交联等作用依旧会降解DNA。

1.3.3 转化

自然转化是ext/intDNA环境行为的重要部分，同时，extDNA自然转化也是原核生物摄取、整合、使extDNA表达的主要机制。自然转化，或称为遗传转化，是指能够从环境中获取游离态DNA分子的感受态微生物细胞，吸收整合extDNA进入自己基因组的过程。自然转化过程不需要特殊的蛋白机制，因而在环境中频繁发生，尤其是自然感受态微生物细胞。自然转化包括4个关键步骤：感受态细胞表面结合extDNA→细胞壁/细胞膜吸收extDNA→extDNA整合进入细菌基因组→extDNA表达[1](图2)。extDNA成功整合进入细菌基因组后，会通过细胞间的结合及转导作用传播，进而进入基因传递网络[58]。extDNA整合进入细菌基因组并引起表达是extDNA自然转化的关键步骤，细胞质中未被整合的extDNA会很快被降解并进入DNA代谢循环[1]。

但是，并不是所有的ext/intDNA都能够成功整合进入细菌基因组，这取决于外源链和染色体DNA之间的同源区域。片段大小在20～200 bp的DNA片段更容易成功整合并引起表达[58]；de Vries等[59]研究发现，外源DNA分子链不符合不动杆菌属(Acinetobactersp.)菌株BD413目标受体染色体DNA之间的同源区域时，其整合效率比更适同源区域DNA外源链的整合效率低109数量级；当其外源片段DNA符合受体染色体DNA同源区时，其整合效率提高了5个数量级以上。成功进入细菌基因组并实现表达的ext/intDNA片段则可能进入细菌基因循环。新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因(nptⅡ)是一类调控植物对卡那霉素产生抗性的基因，但是在土壤非目标细菌中检测到了这一类基因存在，如感受态细菌Acinetobactersp. BD413，BD413通过同源重组获取nptⅡ基因，从而产生对卡那霉素的抗生素抗性[60-61]。尽管土壤中大部分细菌都对卡那霉素产生抗性，但是土壤细菌通过同源重组获取抗性基因产生新的抗性细菌，尤其是抗性致病细菌的环境风险值得重视。

图2 环境胞外DNA自然转化过程Fig. 2 Natural transformation of extracellular DNA

土壤中extDNA其他环境行为也会影响参与自然转化过程的有效态extDNA。Khanna和Stotzky[50]探究了吸附于矿物和砂砾等物质表面的extDNA自然转化效率，发现extDNA从土壤颗粒中解吸并不能直接引起自然转化发生，但是extDNA吸附于土壤颗粒时的确降低了自然转化发生的频次，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)在灭菌土壤体系中的自然转化频次比纯水体系中降低了一个数量级。同时，土壤种类也会影响自然转化频次。Nielsen等[62]研究发现，Acinetobactersp. BD413在未添加营养物质的壤土及砂土中自然转化发生的频率并不相同，在砂土中BD413的自然转化频率是10-4，壤土中为10-7，砂土中BD413自然转化发生的频率比壤土中的频次高3个数量级以上。通常情况下，土壤中热点区域如根际、细菌生物膜和营养物质流动区等，extDNA自然转化发生的频次相对较高[63-64]；自然转化过程一旦发生，extDNA的遗传物质信息即会通过接合和传导成功进入土壤微生物群落。因而，extDNA作为一种遗传物质信息，其在物质循环及生态功能中的作用更应该受到关注[31]。

2 ext/intDNA在细菌生物膜形成中的作用(The Role of ext/intDNA in biofilms formation)

细菌生物膜是由微生物、有机质和一些非有机固体组成的混合物，有机质组成中包含多糖、脂质、蛋白质和核酸，尤其是extDNA等[5,65]。生物膜在水体环境中十分丰富，可以保护细菌免受不适环境的影响，如抗生素、重金属及农药污染胁迫；且由于细菌生物膜具有细胞密度较高的内聚三维网络结构，更容易发生细胞间的相互作用，促使基因信息在extDNA等移动遗传元件中积累，并通过群体感应和水平基因交换等过程实现遗传信息的交流[66-68]。

对基质表面的初始粘附和细菌的聚集是生物膜形成中的重要步骤[69]。Das等[70]发现，细胞表面存在的extDNA一方面参与酸碱相互作用，另一方面为细菌粘附到疏水表面提供热力学有利条件，能够增强细菌生物膜形成时的粘附及细菌表面聚集作用，因而，extDNA是细菌生物膜形成中的重要介质[71]。目前，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PAO1)和葡萄球菌(Staphylococcus)常被用于探究extDNA在细菌生物膜形成中的作用。

2.1 Pseudomonas aeruginosa extDNA与其生物膜形成

PAO1是一种致病力较低，但抗药性较强的杆菌，属于革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。

extDNA是P.aeruginosa生物膜形成中的重要结构前体[72]。前人研究证实，extDNA在P.aeruginosa生物膜中是作为细胞-细胞互连基质的化合物[73]；P.aeruginosa是通过外膜释放小囊泡的方式形成extDNA，群体感应也在生物膜形成中起重要作用[74-75]。假单胞菌喹诺酮信号传导分子(Pseudomonasquinolone signaling, PQS)诱导原噬菌体侵染浮游生物释放extDNA，extDNA与细胞形成冠状结构后，细胞再通过Ⅳ型菌毛发生移动，并与extDNA相互作用慢慢聚集到冠状结构顶部。Whitchurch等[76]发现在实验体系中添加DNA酶后，PAO1生物膜形成被抑制，这说明extDNA是生物膜形成中的一种重要结构成分；同时，实验中还设计在已经形成12、36、60和84 h的生物膜中加入DNA酶，发现形成84 h后的生物膜受影响程度最低，这说明形成时间较久的生物膜不易被DNA酶影响，可能的原因是extDNA在此过程中被其他物质强化或生物膜产生了局部灭活DNA酶的蛋白外酶。

extDNA也能够保护PAO1生物膜抵御外部污染物质影响。extDNA可以结合带正电荷的抗菌剂，如氨基糖苷类和抗微生物肽，使得PAO1生物膜免受氨基糖苷类的影响[77]。有研究表明，extDNA能够与阳离子结合，创造阳离子限制型环境，诱导PAO1产生pmr基因，增强其对氨基糖苷类和抗微生物肽抗性[73]；Chiang等[78]设计流动室生物膜实验证实，外源补充的extDNA能够整合进入PAO1生物膜，并增加PAO1对氨基糖苷类的耐受性；同时，缺失释放extDNA能力的PAO1群体，形成的生物膜比野生型生物膜更容易受到氨基糖苷类影响，但是补充外源extDNA后又能使其对氨基糖苷类药物耐受，这种耐受性可能来自于extDNA的保护作用。

2.2 Staphylococcus extDNA与其生物膜形成

Staphylococcus是一类革兰氏阳性球菌，需氧或兼性厌氧，少数专性厌氧，是医院交叉感染的重要来源[79]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和腐生葡萄球菌是葡萄球菌的3种主要类别。

S.aureus和S.epidermidis都能够形成生物膜[79-81]。生物膜会保护细菌细胞免受抗生素侵染及宿主防御机能的杀伤，前人研究证实生物膜形成在金黄色葡萄球菌伤口感染和骨髓炎及表皮葡萄球菌导管感染中发挥作用。胞外前聚体在S.aureus和S.epidermidis生物膜形成中发挥了重要作用，如extDNA和聚(1,6)-N-乙酰基-D-葡萄糖胺。extDNA是S.aureus和S.epidermidis生物膜形成中的重要胞外前聚体，能够介导表面附着和细胞间粘附作用。Izano等[80]使用DNase Ⅰ在96孔微量滴定板中抑制S.aureus和S.epidermidis生物膜形成，分离抑制条件下形成生物膜，测定生物膜对阳离子洗涤剂氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride, CPC)的敏感性。研究发现，DNase Ⅰ会破坏S.aureus生物膜形成使其对CPC敏感，但对S.epidermidis生物膜作用不显著，这表明extDNA在2种菌株生物膜形成中发挥着不同的结构作用，extDNA是S.aureus生物膜形成及抵御CPC杀伤主导的结构成分，而在S.epidermidis生物膜中，extDNA可能与其他胞外前聚体协同影响生物膜形成。S.epidermidis生物膜中extDNA的产生主要由自溶素AtlE控制，自溶素AtlE能够引起生物膜细胞亚群裂解，导致DNA释放到基质中[79]。extDNA可在基质中作为结构组分、细胞间聚集的促进因子、表面结构粘附素、N/P营养源，调控微生物群落中的遗传信息交换。缺乏AtlE基因的S.epidermidis菌株形成的生物膜具有比野生型更低的extDNA丰度，并且能够引起体内感染的能力显著降低，表明extDNA在生物膜的致病机制中发挥重要作用[81]。此外，S.epidermidis生物膜中extDNA对二价阳离子的螯合作用可能导致生物膜抗生素耐受性提高。Doroshenko等[82]探究发现，在亚抑菌浓度万古霉素的影响下，S.epidermidis生物膜RP62A中万古霉菌的迁移被抑制，使用DNase处理生物膜，发现亚抑菌浓度万古霉素能够延长生物膜的持久性；试验结果表明，在亚抑菌浓度万古霉素影响下，生物膜中的extDNA的浓度上升，这说明，生物膜中extDNA可能抑制了万古霉素的活性；同时添加外源extDNA和万古霉素，S.epidermidis生物膜中浮游生物的半数致死浓度增加，这验证了外源DNA保护生物膜中的细胞免受抗生素攻击。

3 ext/intDNA生物功能信息传递(Biological functions and information transmission of ext/intDNA)

3.1 ext/intDNA与营养元素循环

extDNA在降解后基因信息可能不被保存，但是其降解后的元素，如C、N、P和O等元素依旧存在于环境体系，可以用于从头合成DNA，或者可以离开DNA循环进入它们各自的元素营养循环，即参与食物链中的元素大循环[1,83]。

DNA是一种重要的P元素来源，DNA分子中10%的质量为P元素，Turner等[84-85]发现，自然湿地土壤中以DNA形式存在的可提取态P占22%～53%，苔原土壤中则占9%～13%。Dell’Anno和Danovaro[17]通过比较总DNA及intDNA的方法测量出深海沉积物中90%以上DNA都为extDNA；使用extDNA专性降解酶，发现60%±4%的DNA均可降解，这说明只有部分extDNA能够被降解。据统计，沉积物来自于extDNA中的P源占总有机P的3%，高脱氧核糖核酸酶活性能够证明extDNA是P循环的重要推动者，沉积物表层10 cm中extDNA再矿化占总有机P再矿化的17%。同时，Dell’Anno和Danovaro[17]还发现对浮游生物来说，extDNA降解能够为其提供4%C源、7%N源和47%P源。其中，已有研究表明，流感嗜血杆菌(Haemophilisinfluenza)和淋病奈瑟菌(Nesseriagonorrhoeae)都能够通过膜蛋白吸收同源和异源extDNA用于自然转化，修复自身基因组DNA损伤或将extDNA作为自身营养来源[31]。

3.2 ext/intDNA的基因信息传递

Steinberger和Holden[21]使用随机扩增多态性DNA分析(RAPD)比较了多物种生物膜中extDNA与intDNA的指纹图谱，发现extDNA中的物种信息与总DNA和intDNA中的物种信息并不相同；近年来，随着高通量测序技术及宏基因组技术的发展，更多研究使用16S rRNA高通量测序技术比较分析ext/intDNA中物种多样性信息[20,34,43,86]。结果显示，环境中ext/intDNA都来源于多种物种，一方面，extDNA可在环境中持久存在，其对应物种可以包含历史变迁物种[35]；另一方面，并不是所有的物种分泌的extDNA都能够在环境中保存，因而，intDNA和extDNA分别对应的物种信息并不一一对应，有其相似性，也有不同。

Corinaldesi等[19]使用16S rDNA和18S rDNA技术探究了厌氧深海沉积物中extDNA的来源、保存情况和遗传印记等信息，发现尽管在深海沉积物中DNA酶活性非常高，但是依旧检测到大量extDNA存在，16S rDNA和18S rDNA基因拷贝数很高，分别为109～1010copies·g-1(沉积物)和109～1011copies·g-1(沉积物)，说明其中extDNA含有大量基因序列。因而，从这些环境体系分离得到extDNA和intDNA，并对其对应的物种信息和基因信息进行判定是近年来关于ext/intDNA的研究热点之一。

3.2.1 ext/intDNA与功能基因

功能基因(fuctional genes)是一类能够调控C、N、P、S和Fe元素循环、指示环境微生物功能的基因，广泛存在于土壤、水体和沉积物等环境体系中，通常与元素循环和蛋白调控等功能相关联。

常见的功能基因有四大类，一类是生物地球化学循环基因(biogeochemical cycle genes, BCGs)，通常与C、N、P、S和Fe等元素转化有关，如N硝化基因amoA、N反硝化基因nosZ、nirK/S等，其与N硝化/反硝化过程紧密结合，通常基因丰度与反应过程快慢密切相关；第二类是抗生素抗性基因类(antibiotic resistance genes, ARGs)，抗性基因是抗性遗传信息的载体，通常与抗生素种类有关，如四环素类抗性基因tetW、tetM和tetQ等，目前关于抗性基因与ext/intDNA相互关系的研究较多；第三类功能基因与系统发育标记有关(phylogenetic marker genes, PMGs)，代表基因有指示GTP结合蛋白的基因lepA、蛋白质翻译延伸因子G基因fusA等；第四类功能基因是植株致病基因(plant pathogenicity genes, PPGs)，代表基因有与生物合成和调节thaxtomin(植物毒素，一种含有4-硝基吲哚的二肽分子)相关的基因txtA、txtB等。这里介绍BCGs与ext/intDNA的相互关系。

目前，关于extDNA和intDNA分离后各自体系中含有的BCGs的研究较少，多数研究利用荧光定量PCR技术和宏基因组学技术探究总DNA中含有的BCGs[83,87]；Gómez-Brandón等[83]使用荧光定量PCR技术，选择C-循环基因引物(cell、xyl、alfagluc和betagluc)、P-循环基因引物(acP、alkP、bisP、leu和lys)、S-循环基因引物(aryS)以表征森林不同土壤类型和不同土壤深度下ext/intDNA中含有的基因对应酶活性及其对应细菌-真菌-古菌物种，并使用extDNA与intDNA比值表征生物活性，发现ext/intDNA中表征的基因类型、对应物种组成均不相同；覆盖有地被植物的森林土壤比草地和落叶覆盖的森林土壤具有更高的酶活性；草地覆盖的深层土壤具有较高的extDNA/intDNA，这表明，随着土层深度增加土壤生物活性较低且extDNA更容易降解。值得注意的是，沉积物和土壤中的extDNA含量高于intDNA，extDNA含有丰富的C、N、P和O等元素，在16S rDNA和18S rDNA基因拷贝数中也占据较高比例，并且微生物释放的extDNA积极参与吸附、降解和自然转化等环境过程，是环境中不可忽视的营养元素、基因信息来源[88]。因而，上述环境样品中分别来源于extDNA和intDNA的BCGs比例、以及这些BCGs是否会通过自然转化被其他微生物获取整合、并参与微生物功能注释直至影响微生物群落物质转化与能量传递，依旧是值得深入探究的问题。

3.2.2 ext/intDNA与抗性基因

中国是世界上最大的抗生素使用国之一。医疗及畜禽养殖中使用的抗生素通常不会被人体及畜禽完全代谢吸收，超过90%抗生素会通过排泄等进入环境，进而在长期的自然筛选中，诱发环境中抗性细菌的富集，引发过量抗性基因的表达[89]。抗性基因可能位于染色体和一些移动遗传元件上，如质粒、转座子或整合子，在环境中作为细胞内抗性基因(intracellular antibiotic resistance genes, iARGs)和细胞外抗性基因(extracellular antibiotic resistance genes, eARGs)存在[13,34]。iARGs可通过自我复制传递给后代，也能够通过水平基因转移(接合或传导)等方式传递给其他物种；eARGs则可能通过自然转化被细菌吸收[13,90]。已有的研究表明，缓症链球菌(S.mitis)和口腔链球菌(S.oralis)这2种菌株具有盘尼西林抗生素抗性，其抗性基因pbp2x能够传递给肺炎链球菌(S.pneumoniae)菌株，使后者也具有盘尼西林抗性；前者也能从非典型韦荣菌(Veillonelladispar)菌株处获取四环素抗性。因而，e/iARGs在环境中的存留和传播值得探究，eARGs由于能够通过转化进入细菌体内，其对人体健康及生态系统造成的威胁更应该受到关注[1]。

已有学者研究发现，在河流、湖泊、沼泽及极少受人为干扰的地下水、冰川和水库等水体环境中都分别检测到了i/eARGs的存在[13,24,90-93]。Zhang等[94]采集渤海海岸附近的水体及沉积物样品，使用荧光定量PCR检测样品中的sul1、sul2、tetM、tetB、blaTEM和qnrS等抗性基因，发现水体中eARGs相对丰度为(4.30±1.30)×10-1基因拷贝数，沉积物中则为(2.60±0.30)×10-3基因拷贝数；同时，样品中eARGs丰度显著高于iARGs。Guo等[24]采集了来自长江口的自然水体、沉积物及生物膜样品，探究5类22种ARGs的检出率及丰度，大部分基因的检出率及丰度高低依次是：生物膜>沉积物>水体；这归因于环境中高浓度的抗生素，加速了生物膜中ARGs的产生及传播；同时大多数来自于生物膜及沉积物中的ARGs为eARGs，eARG占总ARGs 60%以上，且与生物膜及沉积物中总有机碳(TOC)显著正相关，eARGs在生物膜-水中的分配系数>沉积物-水中的分配系数，充分说明生物膜是水体环境中重要的ARGs来源。Dong等[34]检测了来自医疗废水、制药业、污水处理厂和猪粪的污泥样品，以及城市湖泊沉积物中的10类抗性基因sul1、sul2、tetW、tetX、ermA、ermB、blaTEM、ampC、cat、cmr和一类转座子(intI1)，发现eARGs丰度检测范围在7.31×103～1.16×1010copies·g-1(干重污泥)，iARGs变化范围在1.04×105～2.74×1012copies·g-1(干重污泥)；研究使用携带β-内酰胺抗性基因(blaSHV)的质粒pMD20-T作为一种eARG，大肠杆菌E.coliDH 5α作为受体，探究eARG在环境中的转化能力，发现沉积物吸附态eARG和游离态eARGs的转化效率分别为每微克质粒DNA中含(1.21±0.19)×103转化体和(6.67±0.53)×102转化体，并且与游离态extDNA相比，吸附态extDNA更容易与感受态细胞耦合，这与前人的研究结果[95-96]一致，可能与DNA的构象有关，具体机制还有待探明。

4 研究不足与研究展望(Research disadvantages and prospect)

目前，关于环境中ext/intDNA较为全面的研究主要集中于ext/intDNA环境行为、extDNA在不同模式菌株生物膜形成中的表面粘附及聚集细菌等作用、不同环境体系中e/iARGs的丰度及其与对应微生物的生态关系等内容。但是，ext/intDNA环境功能及生态效应研究依旧是值得关注的问题。

(1)精准分离环境中不同形态ext/intDNA及对其精准定量是研究ext/intDNA环境功能及生态效应的技术基础[7-8,13,97]。现行的提取土壤/水体/沉积物等体系中ext/intDNA的方法是使用磷酸盐缓冲溶液提取，难以区分游离态、松散结合态及紧密结合态extDNA，提取效率不稳定，因而难以区分不同形态extDNA的具体环境效应；同时，环境中ext/intDNA来源广泛，包括细菌、真菌、放线菌和噬菌体等，同时0%～83% extDNA来源于死亡微生物，细菌、真菌等微生物对extDNA的贡献比例及不同环境体系extDNA来自死亡微生物的比例依旧值得探索。

(2)验证ext/intDNA中功能基因含量及其是否作为活跃的基因携带者积极参与环境过程是探究ext/intDNA环境功能及生态效应的理论基础。目前常使用荧光定量PCR检测技术判定ext/intDNA功能基因含量，使用高通量测序技术分析功能基因携带者；宏基因组学分析能够同时测定功能基因含量，鉴定功能基因携带者。因而，ext/intDNA-宏基因组学分析可能是同时判定环境体系ext/intDNA不同微生物群落组成、基因丰度及其功能的更为有效的检测技术。

(3)探明ext/intDNA对植株-动物-微生物病原体的抵御机制是拓展ext/intDNA环境功能及生态效应研究的重要依据。extDNA是植株根冠粘液基质中的一种重要组分，在植株抵御病原体的过程中发挥重要作用[98]；但是植株extDNA产生的来源及extDNA在植株体内对病原体的抵御机制尚不明确。植株extDNA的获取来源、抵御机制以及这种抵御机制与植株体内其他抵御机制的合作关系等，都有待深入探明。

(4)ext/intDNA环境功能及生态效应研究最终落脚于探究ext/intDNA在生态群落多样性中发挥的作用。ext/intDNA中包含的功能基因及其指示微生物种群各自参与环境过程并不相同，对生态系统的调控作用也有差别；因而，为探明ext/intDNA在生态功能多样性中的重要作用，还应理解ext/intDNA营养元素物质循环、功能微生物种群历史变迁和功能微生物生态位等过程。

综上，ext/intDNA在环境中参与吸附、降解和自然转化等环境过程，extDNA帮助形成细菌生物膜及在细菌生物膜中为微生物缓冲来自抗生素、农药和重金属等污染物的环境压力，ext/intDNA在物质传递、功能基因水平转移过程中都有其独特的环境功能及生态意义，但环境中ext/intDNA定量及其生态功能多样性依旧值得进一步探索。