云南水牛mtDNA D-loop遗传多样性研究

亐开兴, 金显栋， 张继才， 尹以昌， 李红伟， 和嘉荣， 和占星, 罗再仁， 雷初朝， 黄必志*

(1. 云南省草地动物科学研究院，昆明 650212；2. 德宏州畜牧站，云南 德宏 678400；3. 红河州畜牧技术推广站，云南 蒙自 661100；4. 云南省种畜繁育推广中心，昆明 650212；5. 盈江县农业农村局，云南 盈江 679300；6. 西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

水牛是热带、亚热带地区的重要家养动物，能为人类提供肉、奶等，且是水稻种植区的重要役用动物。根据核型、表型等将水牛分为两种类型：江河型水牛(2n= 50)和沼泽型水牛(2n= 48)[1]。几乎所有的中国水牛均为沼泽型水牛。云南省水牛饲养量位居全国第二，主要分布于德宏、西双版纳、昭通、红河、大理、临沧、昆明郊县等地[2]。德宏水牛、滇东南水牛与盐津水牛是云南省最主要的3个地方品种。在距今约3000年前的“沧源崖画”依稀刻有水牛和水牛角，表明云南水牛文化源远流长。

哺乳动物线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)结构简单、遵循母系遗传，且无重组、进化快，被广泛地用于动物的系统发育、演化和遗传多样性等方面的研究中[3]。线粒体DNA的高变区(mtDNA D-loop)，变异速率为其它片段的5～10倍，是研究动物母系遗传的常用分子标记。迄今为止，在水牛上已有大量基于mtDNA D-loop的研究[4-8]。目前的研究表明，沼泽型水牛可以分为2个主要支系(A、B及其亚支系)和3个稀有支系(C、D、E)[6-8]。而云南地区的水牛具有较高的遗传多样性，且位于沼泽型水牛的驯化中心[6-8]。亐开兴等通过对29条滇东南水牛mtDNA D-loop序列进行分析，将滇东南水牛分为A、B两个支系[9]；张自芳等通过对35条滇东南水牛mtDNA D-loop序列的进一步分析，也检测到A、B两个支系，且在B支系中检测到了两个亚支系(B1和B2)[10]。本研究通过对3个云南水牛品种(德宏水牛、滇东南水牛与盐津水牛)的mtDNA D-loop全序列进行分析，以探讨云南水牛的遗传多样性及母系起源，对促进云南水牛的种质资源保存和持续利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 水牛样品信息

从红河州蒙自县采集29头滇东南水牛血样，从德宏州采集32头德宏水牛血样，颈静脉血3～5 mL，肝素钠抗凝，低温运回实验室，-20 ℃保存备用。按常规酚/氯仿法提取水牛的总DNA，稀释至20 ng/μL。此外，从已发表的论文中获取154个云南水牛mtDNA D-loop数据(德宏水牛71个，滇东南水牛54个和盐津水牛29个)[7,8]。

1.2 水牛mtDNA D-loop区的引物、PCR扩增与序列测定

水牛mtDNA D-loop区PCR引物参照Kierstein等[11]发表的文献，正向引物L15617：5′-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3′，反向引物H399：AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3′，测序内引物1为：5′-CCATCAACACACCTGACC-3′，测序内引物2为：5′-CCATGCTCACACATAACTGTGC-3'。PCR扩增反应：94 ℃预变性4 min，然后94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，36个循环；72 ℃后延伸7～10 min。利用正反链双向测序，并用两个内引物进行重叠测序，以获得水牛完整mtDNA D-loop区序列，测序由上海生工生物技术有限公司完成。

1.3 数据分析

序列由DNAStar 5.0软件包Seqman人工校对。利用DnaSP 5.0软件计算单倍型多样性、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数。利用IQ-tree构建ML系统发育树。

2 结果与分析

2.1 水牛mtDNA D-loop长度变异及其序列特征组成

分析发现215条云南水牛mtDNA D-loop全序列长度为900～917 bp，这种长度变化主要是由于水牛mtDNA D-loop全序列含有3个Poly G/C/T(7～10个重复)插入缺失结构导致的。水牛mtDNA D-loop全序列由A、T、G、C四种碱基组成，其中A碱基含量最高(31.0%)，其次为T(27.6%)和C(26.3%)，G碱基含量最低(15.1%)。A+T的平均含量为58.6%，G+C的平均含量为41.4%，A+T的平均含量明显高于G+C，表现出碱基的偏好性。

2.2 云南水牛的mtDNA遗传多样性

对这215头水牛mtDNA D-loop全序列进行比对，共检测到107个变异位点，定义了86种单倍型。分析结果表明，这3个云南水牛品种的mtDNA遗传多样性非常丰富(表1)。其中，德宏水牛、滇东南水牛和盐津水牛的单倍型多样性(Hd)分别为0.907±0.023、0.946±0.017和0.805±0.063，核苷酸多样性(Pi)分别为0.0141±0.0017、0.0162±0.0018和0.0141±0.0031，平均核苷酸差异数(k)分别为12.60、14.58和12.66。相比于德宏水牛和滇东南水牛，盐津水牛的遗传多样性较低。

表1 云南3个水牛品种的mtDNA遗传多样性参数

2.3 云南水牛mtDNA D-loop系统发育分析

以非洲水牛为外群，利用IQ-tree构建云南水牛ML树。ML系统发育树的结果表明，在3个云南水牛品种中存在A和B两个主要支系，以及稀有支系C(图1)。其中，A支系又可以细分为A1、A2与A3亚支系，B支系可细分为B1、B2与B3亚支系。

图1 云南3个水牛品种的ML系统发育树

2.4 网络分析

构建了云南3个水牛品种的网络关系图(图2)，从图2可以看出，215头水牛可分为2个主要支系(A支系和B支系)和稀有支系C(仅在1头德宏水牛中检测到)，此结果与ML系统发育树得到的结果一致。其中，A支系又可以分为A1、A2与A3亚支系，B支系可分为B1、B2与B3亚支系，且A1与A2亚支系形成明显的星形结构，说明沼泽型水牛A支系在驯化传播过程中经历了强烈的群体扩张。在这215个个体中，A支系为主要支系，占79.07%，B支系仅占20.47%。

图2 云南3个水牛品种的mtDNA D-loop网络结构

3 讨 论

研究共分析了215头云南水牛的mtDNA D-loop序列(900～917 bp)，包括103头德宏水牛、83头滇东南水牛、29头盐津水牛，其碱基含量分为为：A(31.0%)、T(27.6%)、C(26.3%)和G(15.1%)，呈现明显的碱基偏好性，这与脊椎动物的特征一致[12]。此外，A+T的含量明显高于G+C，这与其他物种的研究结果一致，说明物种之间的mtDNA D-loop含量相似[13,14]。

单倍型多样度(Hd)和核苷酸多样度(Pi)常用来衡量一个群体mtDNA的变异程度。本研究结果表明，在这3个云南水牛品种中，滇东南水牛的遗传多样性最高(Hd：0.946±0.017，Pi: 0.0162±0.0018)，盐津水牛的遗传多样最低(Hd：0.805±0.063，Pi: 0.0141±0.0031)，这与之前的研究结果相似[8]。盐津水牛较低的遗传多样性，可能与检测的样本数较少有关。总的来说，与中国其他地区的水牛相比，云南地方水牛呈现出较高的遗传多样性[7,8]。越来越多的研究表明，沼泽型水牛可能在中国西南与东南亚交接地区被驯化，而云南水牛如此高的遗传多样性也印证了这一观点[7,15-17]。

沼泽型水牛分为2个主要支系(A和B支系)及3个稀有支系(C、D、E)[10-13]。本研究结果表明，云南3个水牛品种存在A(A1,A2,A3)和B(B1,B2,B3)2大支系及稀有支系C，未检测到稀有支系D和E。其中，A支系为主要支系，占79.07%，这和发表的研究结果一致[7,18-20]。此外，网络图的结果表明，A支系呈现明显的星形结构，说明沼泽型水牛A支系在驯化传播过程中经历了强烈的群体扩张。