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云南水牛mtDNA D-loop遗传多样性研究

2020-04-07亐开兴金显栋张继才尹以昌李红伟和嘉荣和占星罗再仁雷初朝黄必志

中国牛业科学 2020年6期
关键词:支系德宏水牛

亐开兴, 金显栋, 张继才, 尹以昌, 李红伟, 和嘉荣, 和占星, 罗再仁, 雷初朝, 黄必志*

(1. 云南省草地动物科学研究院,昆明 650212;2. 德宏州畜牧站,云南 德宏 678400;3. 红河州畜牧技术推广站,云南 蒙自 661100;4. 云南省种畜繁育推广中心,昆明 650212;5. 盈江县农业农村局,云南 盈江 679300;6. 西北农林科技大学动物科技学院,陕西 杨凌 712100)

水牛是热带、亚热带地区的重要家养动物,能为人类提供肉、奶等,且是水稻种植区的重要役用动物。根据核型、表型等将水牛分为两种类型:江河型水牛(2n= 50)和沼泽型水牛(2n= 48)[1]。几乎所有的中国水牛均为沼泽型水牛。云南省水牛饲养量位居全国第二,主要分布于德宏、西双版纳、昭通、红河、大理、临沧、昆明郊县等地[2]。德宏水牛、滇东南水牛与盐津水牛是云南省最主要的3个地方品种。在距今约3000年前的“沧源崖画”依稀刻有水牛和水牛角,表明云南水牛文化源远流长。

哺乳动物线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)结构简单、遵循母系遗传,且无重组、进化快,被广泛地用于动物的系统发育、演化和遗传多样性等方面的研究中[3]。线粒体DNA的高变区(mtDNA D-loop),变异速率为其它片段的5~10倍,是研究动物母系遗传的常用分子标记。迄今为止,在水牛上已有大量基于mtDNA D-loop的研究[4-8]。目前的研究表明,沼泽型水牛可以分为2个主要支系(A、B及其亚支系)和3个稀有支系(C、D、E)[6-8]。而云南地区的水牛具有较高的遗传多样性,且位于沼泽型水牛的驯化中心[6-8]。亐开兴等通过对29条滇东南水牛mtDNA D-loop序列进行分析,将滇东南水牛分为A、B两个支系[9];张自芳等通过对35条滇东南水牛mtDNA D-loop序列的进一步分析,也检测到A、B两个支系,且在B支系中检测到了两个亚支系(B1和B2)[10]。本研究通过对3个云南水牛品种(德宏水牛、滇东南水牛与盐津水牛)的mtDNA D-loop全序列进行分析,以探讨云南水牛的遗传多样性及母系起源,对促进云南水牛的种质资源保存和持续利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 水牛样品信息

从红河州蒙自县采集29头滇东南水牛血样,从德宏州采集32头德宏水牛血样,颈静脉血3~5 mL,肝素钠抗凝,低温运回实验室,-20 ℃保存备用。按常规酚/氯仿法提取水牛的总DNA,稀释至20 ng/μL。此外,从已发表的论文中获取154个云南水牛mtDNA D-loop数据(德宏水牛71个,滇东南水牛54个和盐津水牛29个)[7,8]。

1.2 水牛mtDNA D-loop区的引物、PCR扩增与序列测定

水牛mtDNA D-loop区PCR引物参照Kierstein等[11]发表的文献,正向引物L15617:5′-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3′,反向引物H399:AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-3′,测序内引物1为:5′-CCATCAACACACCTGACC-3′,测序内引物2为:5′-CCATGCTCACACATAACTGTGC-3'。PCR扩增反应:94 ℃预变性4 min,然后94 ℃变性1 min,56 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,36个循环;72 ℃后延伸7~10 min。利用正反链双向测序,并用两个内引物进行重叠测序,以获得水牛完整mtDNA D-loop区序列,测序由上海生工生物技术有限公司完成。

1.3 数据分析

序列由DNAStar 5.0软件包Seqman人工校对。利用DnaSP 5.0软件计算单倍型多样性、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数。利用IQ-tree构建ML系统发育树。

2 结果与分析

2.1 水牛mtDNA D-loop长度变异及其序列特征组成

分析发现215条云南水牛mtDNA D-loop全序列长度为900~917 bp,这种长度变化主要是由于水牛mtDNA D-loop全序列含有3个Poly G/C/T(7~10个重复)插入缺失结构导致的。水牛mtDNA D-loop全序列由A、T、G、C四种碱基组成,其中A碱基含量最高(31.0%),其次为T(27.6%)和C(26.3%),G碱基含量最低(15.1%)。A+T的平均含量为58.6%,G+C的平均含量为41.4%,A+T的平均含量明显高于G+C,表现出碱基的偏好性。

2.2 云南水牛的mtDNA遗传多样性

对这215头水牛mtDNA D-loop全序列进行比对,共检测到107个变异位点,定义了86种单倍型。分析结果表明,这3个云南水牛品种的mtDNA遗传多样性非常丰富(表1)。其中,德宏水牛、滇东南水牛和盐津水牛的单倍型多样性(Hd)分别为0.907±0.023、0.946±0.017和0.805±0.063,核苷酸多样性(Pi)分别为0.0141±0.0017、0.0162±0.0018和0.0141±0.0031,平均核苷酸差异数(k)分别为12.60、14.58和12.66。相比于德宏水牛和滇东南水牛,盐津水牛的遗传多样性较低。

表1 云南3个水牛品种的mtDNA遗传多样性参数

2.3 云南水牛mtDNA D-loop系统发育分析

以非洲水牛为外群,利用IQ-tree构建云南水牛ML树。ML系统发育树的结果表明,在3个云南水牛品种中存在A和B两个主要支系,以及稀有支系C(图1)。其中,A支系又可以细分为A1、A2与A3亚支系,B支系可细分为B1、B2与B3亚支系。

图1 云南3个水牛品种的ML系统发育树

2.4 网络分析

构建了云南3个水牛品种的网络关系图(图2),从图2可以看出,215头水牛可分为2个主要支系(A支系和B支系)和稀有支系C(仅在1头德宏水牛中检测到),此结果与ML系统发育树得到的结果一致。其中,A支系又可以分为A1、A2与A3亚支系,B支系可分为B1、B2与B3亚支系,且A1与A2亚支系形成明显的星形结构,说明沼泽型水牛A支系在驯化传播过程中经历了强烈的群体扩张。在这215个个体中,A支系为主要支系,占79.07%,B支系仅占20.47%。

图2 云南3个水牛品种的mtDNA D-loop网络结构

3 讨 论

研究共分析了215头云南水牛的mtDNA D-loop序列(900~917 bp),包括103头德宏水牛、83头滇东南水牛、29头盐津水牛,其碱基含量分为为:A(31.0%)、T(27.6%)、C(26.3%)和G(15.1%),呈现明显的碱基偏好性,这与脊椎动物的特征一致[12]。此外,A+T的含量明显高于G+C,这与其他物种的研究结果一致,说明物种之间的mtDNA D-loop含量相似[13,14]。

单倍型多样度(Hd)和核苷酸多样度(Pi)常用来衡量一个群体mtDNA的变异程度。本研究结果表明,在这3个云南水牛品种中,滇东南水牛的遗传多样性最高(Hd:0.946±0.017,Pi: 0.0162±0.0018),盐津水牛的遗传多样最低(Hd:0.805±0.063,Pi: 0.0141±0.0031),这与之前的研究结果相似[8]。盐津水牛较低的遗传多样性,可能与检测的样本数较少有关。总的来说,与中国其他地区的水牛相比,云南地方水牛呈现出较高的遗传多样性[7,8]。越来越多的研究表明,沼泽型水牛可能在中国西南与东南亚交接地区被驯化,而云南水牛如此高的遗传多样性也印证了这一观点[7,15-17]。

沼泽型水牛分为2个主要支系(A和B支系)及3个稀有支系(C、D、E)[10-13]。本研究结果表明,云南3个水牛品种存在A(A1,A2,A3)和B(B1,B2,B3)2大支系及稀有支系C,未检测到稀有支系D和E。其中,A支系为主要支系,占79.07%,这和发表的研究结果一致[7,18-20]。此外,网络图的结果表明,A支系呈现明显的星形结构,说明沼泽型水牛A支系在驯化传播过程中经历了强烈的群体扩张。

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