白僵菌和绿僵菌对棉铃虫的室内防控效果评价

于 健，查 萌，郑梦君，刘小侠

(中国农业大学植物保护学院,北京 100019)

0 引 言

【研究意义】转抗虫基因棉花种植后有所好转，但是棉铃虫在玉米、蔬菜等多种作物上依然常有发生。生物源农药以其较稳定的效果及环境友好，为棉铃虫防治提供了一个选择。【前人研究进展】白僵菌 (Beauveriabassiana)是应用最广的虫生真菌之一[1]，目前,白僵菌已经广泛运用于二斑叶螨Tetranychusurticae、烟粉虱Bemisiatabaci、蓟马Frankliniellaoccidentalis、亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis[2-5]等农林害虫防治。在适宜的温度湿度环境下，白僵菌分生孢子萌发后通过表皮进入寄主体腔。菌丝在血腔内生长[6]，产生有毒代谢物导致寄主死亡最终侵入寄主的所有器官，穿出体壁重新产生孢子[7]。其分生孢子和寄主表皮的相互作用涉及到复杂的专一性和非专一性识别机理[8]。绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)和其它病原真菌侵染寄主的大部分过程一样[9]，除此之外，绿僵菌中会形成特殊结构，如附着孢等，同时分泌各种相应的酶，如几丁质酶、蛋白质降解酶等,破坏寄主体表侵入体内[10, 11]。绿僵菌的菌株产孢能力强且生长迅速，对鞘翅目、鳞翅目和双翅目等 200余种农林害虫表现出明显的致死效果，对地下害虫尤为有效[12, 13]。【本研究切入点】目前采用绿僵菌防治棉铃虫研究较少，且2种真菌控制棉铃虫效果的对比研究也较缺乏。设置不同浓度的2种真菌，并通过不同侵染途径感染棉铃虫后，死亡率和体重抑制率。【拟解决的关键问题】通过不同感染方式，白僵菌和绿僵菌对棉铃虫的毒性主要通过体壁接触感染还是进食感染，设置浓度梯度，研究最为经济有效的浓度，为田间应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试昆虫

棉铃虫集于北京郊区采，在中国农业大学害虫综合实验室用以麦麸和玉米粉为主的人工饲料饲养至少50代。温度为(25±1)℃，相对湿度(75±10)%，光周期16 L∶8 D。

1.1.2 供试药剂

白僵菌孢子粉(9×1010孢子/g)来源于吉林省农业科学院植保所。

绿僵菌孢子粉(2×1010孢子/g)购于盐城市神微微生物菌种科技有限公司。

1.1.3 其他材料

棉铃虫人工饲料；非转基因棉花中棉49号植株。

1.2 方 法

1.2.1 分生孢子悬浮液配制

使用万分之一电子天平分别称取白僵菌孢子粉(9×1010孢子/g)0.833 3、0.083 3和0.008 3 g于3支50 mL离心管中，绿僵菌孢子粉(2×1010孢子/ g)0.025，0.5和0.1 g于3支50 mL离心管中，各加入去离子水至50 mL，旋涡震荡配制成1.5×108、1.5×107和1.5×106孢子/mL 的白僵菌分生孢子悬浮液和1×107、2×107和4×107孢子/mL 3个浓度的绿僵菌分生孢子悬浮液。

1.2.2 浸渍法和饲喂法侵染棉铃虫

取健康生长一致的棉铃虫三龄第1 d幼虫分别浸于配制好的白僵菌和绿僵菌不同浓度的分生孢子悬浮液中，浸渍10 s后用无菌镊子取出幼虫，置于吸水纸上晾干，再将幼虫放入已装好饲料的养虫盒中。每个处理3次重复，每个重复设20头试虫，浸渍无菌水溶液的棉铃虫幼虫为对照组。

剪取新鲜中棉49号棉花棉叶消毒后浸于白僵菌和绿僵菌不同浓度的分生孢子悬浮液中，浸渍1 min后取出，置于吸水纸上自然晾干。将叶片剪成大小一致的边长为1 cm的正方形叶片，放入装有健康的生长一致的棉铃虫三龄幼虫的养虫盒中，待叶片食尽后再放入人工饲料饲养。每处理3次重复，每重复设20头试虫，取食无菌棉叶的棉铃虫为对照组。

将试虫置于培养箱中培养，每隔24 h观察幼虫形态变化，记录幼虫死亡数，并取对照组和处理组各20头试虫编号，在对照组三龄、四龄、五龄、蛹期的第1 d记录对照组和处理组编号试虫的体重。

1.3 数据处理

生物测定数据采用IBM SPSS Statistics统计软件进行方差分析,运用单因素方差分析和Turkey检验方法，P<0.05即视为有显著性，同时用GraphPad Prism软件绘制图形。

校正死亡率 (%)=(处理虫口死亡率 -对照虫口死亡率)/(1 -对照虫口死亡率 )×100%。

2 结果与分析

2.1 不同浓度白僵菌对棉铃虫室内防控评价

2.1.1 感染白僵菌幼虫形态

研究表明，白僵菌悬浮液浸渍处理的第6 d，幼虫体型随菌液处理浓度的增加而减小。对照组棉铃虫已生长到五龄初期，而白僵菌孢子浓度为1.5×106孢子/mL组棉铃虫生长至四龄末期， 1.5×107孢子/mL组棉铃虫生长至四龄初期，1.5×108孢子/mL组棉铃虫仅生长至三龄末期，生长几乎停滞，且出现行动迟缓、拒食等现象。

白僵菌分生孢子悬浮液处理第10 d，对照组棉铃虫幼虫已化蛹，处理组白僵菌侵染死亡的幼虫呈现白色僵死状，体表覆有大量白色菌丝，处理组菌液浓度越高，菌丝覆盖率越大。图1，图2

图1 白僵菌浸渍法处理第6 d棉铃虫形态
Fig.1 Morphology of cuticular infection onH.armigerainfected byB.bassianain the sixth days

图2 白僵菌浸渍法处理第10 d棉铃虫形态
Fig.2 Morphology of cuticular infection onH.armigerainfected byB.bassianain the tenth days

2.1.2 体壁感染白僵菌后对棉铃虫幼虫死亡率和体重的影响

研究表明， 1.5×108孢子/mL白僵菌悬液经体壁侵染棉铃虫后校正死亡率为63%，在5 d达到了最大死亡率，致死效果显著高于低浓度白僵菌。较低的2个浓度白僵菌处理间没有显著性差异。与对照组相比，1.5×108孢子/mL浓度处理后的棉铃虫体重在四龄和五龄分别衰减了46%和57%，显著低于对照组和其他浓度处理。图3，图4

图3 白僵菌浸渍法侵染棉铃虫的校正死亡率
Fig.3 Corrected mortality of cuticular infection onH.armigerainfectedbyB.bassiana

数据代表平均数±标准误, 同一龄期，不同浓度根据单因素方差分析( ANOVA )及Turkey检验方法显著性差异分析,柱上不同小写字母代表差异显著(P<0.05);下同
图4 白僵菌浸渍法侵染下棉铃虫体重变化
Fig.4 Weight of cuticular infection onH.armigerainfected byB.bassiana

2.1.3 消化道感染白僵菌后对棉铃虫幼虫死亡率和体重的影响

研究表明，白僵菌分生孢子悬浮液浓度为1.5×108孢子/mL经饲喂法侵染棉铃虫后校正死亡率最高可以达到38%，浓度降低后对棉铃虫致死率不足30%。不同龄期体重与对照组相比没有显著性差异。图5，图6

图5 棉铃虫饲喂法侵染白僵菌后校正死亡率
Fig.5 Corrected mortality of digestivetract infection onH.armigerainfected byB.bassiana

图6 白僵菌饲喂法侵染下棉铃虫体重变化
Fig.6 Weight of digestive tract infection onH.armigerainfected byB.bassiana

2.2 不同浓度绿僵菌对棉铃虫的室内防控效果

2.2.1 感染绿僵菌幼虫形态观察

研究表明，3种不同浓度绿僵菌分生孢子悬浮液处理的6 d，对照组棉铃虫为五龄初期，1×107孢子/mL组棉铃虫生长至四龄末期，2×107孢子/mL组棉铃虫生长至四龄初期，4×107孢子/mL组棉铃虫生长至三龄末期，且体型依次减小。绿僵菌侵染死亡的棉铃虫幼虫，体型很小，呈黑色僵死状，死亡数天后体壁见白色菌丝。图7

图7 不同浓度绿僵菌孢悬液处理第6 d棉铃虫形态
Fig.7 Morphology of cuticular infection onH.armigerainfected byM.anisopliaein the sixth days

2.2.2 体壁感染绿僵菌后对棉铃虫幼虫死亡率和体重的影响

研究表明，在室内条件下绿僵菌分生孢子悬浮液浓度为4×107和2×107孢子/mL经体壁侵染棉铃虫后校正死亡率均可达70%以上，显著高于1×107孢子 /mL处理的棉铃虫。感染绿僵菌后棉铃虫体重与对照组相比在四龄、五龄、蛹期均显著性降低。与对照相比，4×107孢子/mL浓度处理后的棉铃虫体重在四龄、五龄、蛹期分别减少了85.56%、95.89%、57.7%，显著低于其他处理和其他浓度处理。图8，图9

图8 绿僵菌浸渍法侵染棉铃虫的校正死亡率
Fig.8 Corrected mortality of cuticular infection onH.armigerainfected byM.anisopliae

图9 绿僵菌浸渍法侵染下棉铃虫体重变化
Fig.9 Weightof cuticular infection onH.armigerainfected byM.anisopliae

2.2.3 消化道感染绿僵菌后对棉铃虫幼虫死亡率和体重的影响

研究表明，4×107孢子/mL的绿僵菌经消化道侵染的棉铃虫校正死亡率为65%， 2×107孢子/mL处理的校正死亡率为50%，致死效果显著高于1×107孢子/mL处理。感染绿僵菌后不同龄期体重与对照组相比在四龄和五龄均显著性降低。蛹期体重降低但差异不显著。4×107孢子/mL浓度处理后的棉铃虫体重在四龄、五龄分别减少了66.7%、75.9%，对棉铃虫体重抑制效果弱于经体壁侵染处理。图10，图11

图10 棉铃虫饲喂法侵染绿僵菌后校正死亡率
Fig.10 Corrected mortality of digestive tract infection onH.armigerainfected byM.anisopliae

图11 绿僵菌饲喂法侵染下棉铃虫体重变化
Fig.11 Weight of digestive tract infection onH.armigerainfected byM.anisopliae

3 讨 论

棉花种植业已经成为新疆地区农业的支柱性产业[14, 15]，在推动我国经济高效快速发展的过程中起到了很重要的作用[16]。棉铃虫在20世纪90年代发生棉铃虫大猖獗[17]，转基因棉花快速推广种植让棉花生产不再受到棉铃虫的制约[18, 19]，但是棉铃虫种群的繁殖潜能巨大，对新的环境适应能力很强，还可以远距离迁飞，同时很多地区种植结构改变导致棉铃虫在玉米[20]、花生[21]、核桃[22]的作物上为害，常常在某地条件适宜时的时候快速地大面积暴发成灾[23]。

微生物源杀虫剂普遍包括真菌杀虫剂、细菌杀虫剂和病毒杀虫剂等[24]。其中，因为真菌杀虫剂对昆虫的体壁有独特的侵染方式，相比于细菌和病毒杀虫剂来说，真菌杀虫剂的扩散能力更强，防治谱更广。在真菌杀虫剂中，因为白僵菌和绿僵菌有易培养、致病力强、对多种害虫防效好的特点。

在试验中，高浓度白僵菌和绿僵菌均表现为经体壁侵染棉铃虫的致死率显著性高于经消化道侵染棉铃虫的致死率；1.5×108孢子/mL处理第10 d，体壁侵染校正死亡率为63%，消化道侵染校正死亡率仅有38%。其他鳞翅目幼虫也有类似现象，1×108孢子/mL白僵菌悬液通过饲喂侵染小菜蛾(Plutellaxylostella)9 d时校正死亡率为80.5%[25]。2.3×108孢子/mL白僵菌悬液直接喷洒在小菜蛾体表8 d时校正死亡率为92.4%[26]；1×109孢子/mL的白僵菌浸渍法处理亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)老熟幼虫第10 d死亡率达到96.67%[27]。对白僵菌和绿僵菌侵染甜菜夜蛾(Laphygmaexigua)的组织切片研究中发现，2种真菌主要通过体壁侵染，经取食进入消化道的真菌孢子几乎不能萌发[28]。根据前人研究，鳞翅目昆虫中肠液呈碱性(pH=8.0～10.5)，蛋白酶主要是丝氨酸蛋白酶[29, 30]，糖苷酶主要是淀粉酶和纤维素酶[31]。通过模拟鳞翅目昆虫中肠环境观察白僵菌萌发情况实验中，白僵菌分生孢子在碱性中肠环境下，不仅不利于侵染，一部分会被消化液杀死[32]。同时昆虫肠道微生物对致病真菌侵染也有一定拮抗作用，中肠优势菌群绿脓杆菌、蜡状芽孢杆菌等对绿僵菌有很强拮抗作用[33]。2种真菌通过体壁侵染棉铃虫比通过消化道侵染的校正死亡率更高，体重抑制更好。实验仅在室内条件下研究和评价了绿僵菌和白僵菌对棉铃虫的控制效果，在服务田间应用之前，还应该设置一系列田间试验，评价实际控制效果，并且在施药过程中优化用药体系，探究与其他农药复配可能性。

4 结 论

1.5×108孢子/mL的白僵菌和4×107孢子/mL绿僵菌均对棉铃虫幼虫有较好的致死效果和体重抑制效果。1.5×108孢子/mL的白僵菌侵染棉铃虫三龄幼虫后，到五龄时经体壁侵染比消化道侵染校正死亡率高25%，体重抑制率高57%；4×107孢子/mL绿僵菌侵染棉铃虫三龄幼虫后，到五龄时经体壁侵染比消化道侵染校正死亡率高8%，体重抑制率高20%。