蒙药黄柏膏的质量标准研究＊

白文明，王来兵，包勒朝鲁，那生桑

（内蒙古医科大学药学院 呼和浩特 010110）

药用黄柏膏是芸香科植物黄皮树（Phellodendron chinense Schneid.）的干燥树皮经水提取后的浸膏剂。蒙医用黄柏膏方剂最早记载于《医经八支精义集要》，是治疗血热赤眼、寒风赤眼、痛风、风湿、热性黄水病、黄水疮、斑秃、癣、鼻衄、吐血、崩漏等症的凉性膏剂型蒙成药，又名“希拉·毛敦·罕达”，被西医诊断为急慢性结膜炎，沙眼等症均可服用此药[1]。蒙药是蒙古民族通过长期的生活实践积累下来的宝贵医药财富，现代药理研究证实黄柏膏中含有多种药理活性成分，这些成分具有抗炎[2]、抗菌[3-5]、抗溃疡[6]、抗氧化[7，8]等作用。因其具有内服兼外敷的用药特点，流传至今仍是蒙医临床用药的常用制剂。传统中医药书籍《圣济总录》《圣惠》《卫生总微》《仁术便览》等虽然对黄柏膏进行了记载，但与蒙药用黄柏膏相比，方剂有较大差异，药效及用法亦不同。2015 版《中国药典》一部对黄柏膏制剂原料的黄柏及其炮制品盐黄柏、黄柏炭等制定了科学、系统的质量标准，是现行黄柏药材及其炮制品质量控制的法理依据，但对黄柏膏未制定相应的质量标准，且至今未有任何相关的文献或研究报道。

对蒙药用制剂进行质量标准研究是传承发展传统蒙医药、提高蒙医药事业现代化程度及科学性的前提条件和基础，有非常广泛且实际的需求。本文从性状、检查、鉴别及含量测定等多角度对蒙药用黄柏膏的质量标准进行了科学、系统的研究，制定了符合实际情况的科学、合理的质量标准体系，为建立黄柏膏制剂的质量控制方法提供理论支持。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

iChrom 5100型高效液相色谱仪（大连伊利特分析仪器有限公司）；ODS 色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5μm，大连伊利特）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限责任公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KH5200DE 型数控超声波清洗器（昆山和创超声仪器有限公司）；DHT 型磁力搅拌恒温电热套（山东菏泽石曲化工学校仪器设备厂）。

1.2 试药

各批次黄柏（成都药市，批号150201和160309；呼和浩特药市，批号160501和180701）经鉴定，为芸香科植物黄皮树的干燥树皮，即习称的“川黄柏”。

图1 薄层色谱图

表1 三批黄柏中小檗碱及黄柏碱含量

1.3 化学试剂

盐酸黄柏碱对照品（111895-201504，94.9%，中国食品药品检定研究院）；盐酸小檗碱对照品（110713-201212，86.7%，中国食品药品检定研究院）；黄柏对照药材（Z8ZJ-Y8WD，中国食品药品检定研究院）；磷酸和乙腈为色谱级试剂，冰乙酸、三氯甲烷、氨水、碘化钾、次硝酸铋均为市售分析纯。

2 原药材的质量评价

蒙药用黄柏膏是黄柏原药材经水提而得的浸膏剂。在制备黄柏膏前，须对原药材黄柏的质量进行检测，以保障黄柏膏制剂的药效稳定性和制备样品的代表性。本研究依据收录于2015 版《中国药典》一部的黄柏项下的薄层鉴别及含量测定方法对制剂用原药材的质量进行了评价。结果如下。

2.1 薄层鉴别

参照2015 版《中国药典》一部黄柏项下的薄层鉴别方法，各批次供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（图1）。

2.2 含量测定

参照2015 版《中国药典》一部黄柏项下的含量测定方法，4 个批次黄柏药材的盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量均符合2015版《中国药典》一部要求（小檗碱含量不少于3.0%，黄柏碱含量不少于0.34%，表1）。

结果表明，从鉴别和指标成分含量测定的角度，本研究用于制备黄柏膏的4个批次原药材的质量均符合现行《中国药典》的要求，是合格的黄柏原药材。

3 质量标准研究

3.1 成品性状

棕黄色干膏（或粉末），气微、味苦。

3.2 制法

取净黄柏，照煎煮法（2015 版《中国药典》第四部制剂通则0100）制成干膏，具体步骤如下：取黄柏粗粉，加水浸渍12 h，煎煮1 h，趁热过滤得滤液，残渣加水，煎煮1 h，趁热过滤，合并煎液，重复上述操作，合并滤液。滤液用水浴浓缩至粘稠状，低温干燥，研细，即得。共制得7个批次黄柏膏。

3.3 鉴别

3.3.1 显微鉴别

用显微镜对药材切片、粉末、表面制片及含药材粉末的制剂进行观察，获得药材组织、细胞或内容物等特征是鉴别药材或制剂的常用方法之一。本研究中黄柏膏是水提取浸膏剂，无组织、细胞特征，所以没有显微鉴别的意义。所以，未建立相应的显微鉴别方法。

3.3.2 薄层鉴别

因2015 版《中国药典》一部黄柏项下的薄层鉴别方法比较成熟，故参照此方法制定了黄柏膏制剂的薄层鉴别方法。

取黄柏膏粉末0.2 g，加入1%醋酸甲醇溶液40 mL，于60 ℃超声处理20 min，滤过，滤液浓缩至2 mL，作为供试品溶液。另取盐酸黄柏碱对照品，加入甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2015年版通则0502）实验，吸取上述两种溶液各3-5μL，分别点于同一硅胶G 薄层板，以三氯甲烷∶甲醇∶水（30∶15∶2）的下层溶液为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，分离度符合要求。各批次样品均呈阳性（图2），故作为黄柏膏的薄层鉴别方法。

图2 黄柏膏薄层色谱图

表2 水分含量测定表

3.4 检查

黄柏膏制剂易吸收空气中的水分，因此在不同湿度的环境中，水分含量存在一定差异，而水分含量的较大差异可能直接影响黄柏膏制剂的药效稳定性。故本研究根据各批次制剂粉末中水分含量的测定结果，制定了含水量的限度值，作为黄柏膏质量控制的指标之一。

取本品约3.0 g，照《中国药典》（2015 年版通则0832第二法）水分测定法进行测定（表2）。

结果显示，7 个批次黄柏膏制剂的水分含量在1.51%-2.72%之间，平均值为2.19%。考虑不同储存环境中干湿度的差异，拟定黄柏膏水分含量不得过5.00%。

3.5 含量测定

照《中国药典》（2015 年版通则0512）高效液相色谱法，对盐酸小檗碱及盐酸黄柏碱含量进行测定。

3.5.1 色谱条件与系统适应性

（1）盐酸小檗碱

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，5μm，4.6 mm×250 mm

流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.25 g）

检测波长：265 nm

柱温：25 ℃

流速：1.0 mL·min-1

理论板数：按盐酸小檗碱峰计算应不低于10000

（2）盐酸黄柏碱

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，5μm，4.6 mm×250 mm

流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 ml加十二烷基磺酸钠0.25 g）（36∶64）

检测波长：284 nm

柱温：25 ℃

流速：1.0 mL·min-1

理论板数：按盐酸黄柏碱峰计算应不低于15000

在上述色谱条件下，对盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱进行测定（图3、图4、表3）。

结果显示，在上述色谱条件下供试品溶液中盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的各项系统适应性参数均符合要求。

3.5.2 对照品溶液的制备

取盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，分别加入乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）和乙腈-0.1%磷酸溶液（36∶64）的混合溶剂，制成每1 mL 含0.16 mg和0.4 mg的溶液，即得。

3.5.3 供试品溶液的制备

以流动相为提取液，不同提取工艺条件下制备供试品溶液，分别测得含量数据（表4）。

图3 盐酸小檗碱对照品及黄柏膏的色谱图

图4 盐酸黄柏碱对照品及黄柏膏的色谱图

表3 系统适应性数据

表4 盐酸小檗碱（A）和盐酸黄柏碱（B）的提取工艺考察

结果显示，不同提取工艺条件下测得的盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱含量并无明显差异。考虑到提取方法的简易性，选择25 ℃、超声40 min、提取液体积100 mL 为黄柏膏中盐酸小檗碱的提取工艺；25 ℃、超声30 min、提取液体积25 mL为黄柏膏中盐酸黄柏碱的提取工艺。

3.5.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

图5 盐酸小檗碱标准工作曲线

图6 盐酸黄柏碱标准工作曲线

表5 各对照品溶液浓度及对应峰面积数据

3.5.5 方法学考察

（1）线性关系考察

取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加流动相定容至刻度，得每1 mL 含0.016 mg的溶液。分别进样5μL、10μL、20μL、40μL、50μL，记录对照品峰面积。

取盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，加流动相定容至刻度，得每1 mL 含0.08 mg 的溶液。分别进样5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，记录对照品峰面积。

将进样量换算为对应的浓度，整理数据得表5。

以色谱峰面积为横坐标，对照品浓度为纵坐标，回归得到盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的标准工作曲线（图5、图6）。结果显示，含量测定项下选择的指标成分盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱分别在0.016-0.16 mg·mL-1，0.08-0.4 mg·mL-1浓度范围内呈现良好线性关系，回归方程和回归系数分别为Y= 4.844 × 10-5X+3.604 × 10-4、r= 0.9999，Y= 1.543 × 10-4X+ 5.620 ×10-4、r=0.9999。

表6 盐酸小檗碱（A）和盐酸黄柏碱（B）对应的峰面积

表7 盐酸小檗碱（A）和盐酸黄柏碱（B）稳定性试验数据

表8 同一批次6份供试品溶液的盐酸小檗碱（A）和盐酸黄柏碱（B）含量

表9 盐酸小檗碱（A）和盐酸黄柏碱（B）的加样回收率试验结果

（2）精密度试验

照盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱供试品溶液制备方法制得供试品溶液各1 份，分别于各自确定的色谱条件下连续进样6 次，记录峰面积，结果显示，供试品溶液连续进样6 次后，各色谱图中盐酸小檗碱对应峰面积的RSD 为0.8%，盐酸黄柏碱对应峰面积的RSD 为1.1%，表明对上述两个成分仪器进样精密度良好（表6）。

（3）稳定性试验

照盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱供试品溶液制备方法制得供试品溶液各1 份，分别在制备后的0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 各进样一次，记录对应峰面积（表7）。结果显示，8 h内盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱对应峰面积的RSD 分别为0.6%和1.4%。表明，供试品溶液内的上述两个成分在8 h内是稳定的。

（4）重复性试验

照盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱供试品溶液制备方法制得供试品溶液各6份（100%浓度水平），进样测得对应成分峰面积后，利用标准工作曲线计算得盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱含量（表8）。结果显示，6份相同浓度水平供试品溶液中的盐酸小檗碱含量的RSD 为2.0%，盐酸黄柏碱含量的RSD 为1.3%，表明该方法的精密度良好。

（5）加样回收率试验

取同一浓度的供试品溶液（100%浓度水平）各6份，按加入对照品量与供试品中待测成分量之比控制在1∶0.5、1∶1、1∶1.5左右，进行加样回收率试验（表9）。结果显示，盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的加样回收率分别在94.92%-101.4%和96.75%-105.4%范围之内，表明该方法的准确度良好。

（6）含量测定

照上述含量测定方法，测得7 批次黄柏膏中盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱含量（表10）。根据测得结果，并结合制备工艺及原材料的差异等影响因素，规定黄柏膏中盐酸小檗碱含量不得低于5.50%，盐酸黄柏碱含量不得低于0.84%。

4 讨论

本研究共制得7个批次黄柏膏制剂，其外观、性状间无显著差异，根据其特点总结规定了该制剂的性状特征。在制剂质量控制过程中，对制剂进行鉴别分析是保证制剂质量稳定性和临床用药安全必不可少的环节。黄柏膏为水提浸膏剂，无显微特征，因此无法规定显微鉴别方法。基于此本课题研究开发了以黄柏膏中含有的盐酸黄柏碱成分和制剂用原药材的对照药材为基准的薄层鉴别方法，作为黄柏膏制剂质量控制的鉴别方法。

表10 7批次黄柏膏中盐酸小檗碱（A）和盐酸黄柏碱（B）含量

蒙医用黄柏膏是黄柏药材的水提浸膏，属单方制剂，与常见的复方中药制剂黄柏膏不同，其用法、用量和对应病症亦存在差异。黄柏膏是典型的浸膏固体制剂，具有一定程度的吸湿性，在储存、运输或制剂过程中不可避免的会发生吸潮现象，影响黄柏膏的质量稳定性[9-11]，对黄柏膏的水分含量进行标准化研究对保证药效及临床用药安全具有重要意义。本研究通过测量7个批次黄柏膏制剂的水分含量，并结合不同地区干湿度的差异，制定黄柏膏制剂的水分含量不得＞5.00%。

小檗碱和黄柏碱是黄柏膏中具有代表性的药理活性成分，相关研究证明，小檗碱具有降血糖[12]、降血压[13，14]及神经保护作用[15]，黄柏碱具有免疫抑制作用[16，17]，因此本研究采用上述两个成分含量作为黄柏膏质量标准的含量测定项，并对含量测定方法进行方法学验证，建立了符合现行中国药典规定的含量测定方法。通过测量7个批次黄柏膏中盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱含量，规定黄柏膏中盐酸小檗碱含量不得＜5.50%，盐酸黄柏碱含量不得＜0.84%。

本研究建立的质量控制方法快速简便，且准确度高，对建立完善的黄柏膏质量标准具有重要的理论指导意义。