伞骨草利尿抗炎活性及急性毒性研究＊

吕 涛，吴德松，郑春丽，胡 疆，蔡 建，张荣豪 ，黄先健 ，施晓东 ＊＊

（1. 曲靖师范学院生物资源与食品工程学院 曲靖 655011；2. 曲靖师范学院云南高原生物资源保护与利用研究中心曲靖 655011；3. 云南省药物研究所 昆明 650111；4. 曲靖师范学院文化旅游学院 曲靖 655011）

高血压、水肿胀和炎症是临床上常见疾病，并伴随有多种并发症。利尿药能使电解质和水分排出，同时使血容量减少，心脏血液输出量下降，血压下降。利尿类药可促进肾脏排出溶质及水而增加尿量，能治疗心、肝、肾等疾病所引起的水肿，与降压药联合使用治疗高血压，在临床上被广泛应用[1-5]。炎症是机体对损伤因子所产生的正常防御反应过程，有研究发现炎症与多种疾病的形成有关。非甾体抗炎药、抗生素、维生素等均可以有效治疗炎症及其并发症。然而，长期使用一些西药用于治疗水肿胀、高血压、炎症以及相关的疾病对人体有多种毒副作用。近年来，有关传统中医药通过整体论治、辨证论治、调节患者全身免疫状况等手段，对水肿胀、高血压和炎症性疾病的治疗在临床上也取得了显著疗效，且因其副作用小、药效持久而受到患者的青睐[6-9]。

伞骨草（Eleusine indica（L.）Gaertn.）为一年生草本，根系极发达，秆叶强韧，全株可作饲料，又为优良保土植物。分布于中国南北各省区及全世界温带和热带地区，多生于荒芜之地及道路旁，全世界温带和热带地区也有分布。《中华本草》记载全草煎水服，可防治乙型脑炎[10]。《滇南本草》中记载：伞骨草气息甜美，主治健脾，利水通淋，妇人白带，煎汤服之最良[11]。民间常用于治疗水肿胀、炎症等症状。鉴于此，作者对伞骨草进行了大量的文献资料查阅，发现目前国内外对伞骨草的研究还比较少，故对伞骨草水提取物进行抗炎、利尿活性研究及初步的安全性评价，为其进一步开发利用提供药效学研究基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康 SPF 级 KM 小鼠，全雌性，体质量 18-22 g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2008-0002。

健康 SPF 级 SD 大鼠，180-220 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2015-0001，发证单位：辽宁省科学技术厅。

1.2 样品制备

取伞骨草药材打粉，用蒸馏水提取3 次，合并滤液，滤液减压浓缩，真空干燥，粉碎，得到干浸膏，常温干燥密封保存。

1.3 仪器与试剂

电子分析天平购于梅特勒-托利多公司（型号：AG-285）、普通电子天平购于常熟市双杰测试仪器厂（型号：JJ200）、全自动生化分析仪购于贝克曼库尔特公司（型号：AU5800）、电解质分析仪购于希莱恒有限公司（型号：IMS-972）、YLS-7B 足趾容积测量仪购于济南益延科技发展有限公司公司、二甲苯购于上海久亿化学试剂有限公司（批号：批号：20090837）、呋塞米片购于天津力生制药股份有限公司（批号：1509049）、角叉菜胶购于美国Sigma公司（批号：C10103），阿司匹林购于拜耳医药保健有限公司（批号：BJ32905）。

2 实验方法

2.1 利尿实验[12，13]

取预选试验中排尿功能合格的小鼠60只，随机分为5组，每组12只，雌雄对半，分别为正常组（给药0.5%羧甲基纤维素钠溶液）、阳性药物组（给药10 mg·kg-1的呋塞米，以下简称阳性药组）、伞骨草水提取物低剂量组（0.75 g·kg-1）、伞骨草水提取物中剂量组（1.5 g·kg-1）、伞骨草水提取物高剂量组（3.0 g·kg-1），连续给药7天，实验前禁食不禁水12 h，以减少粪便的干扰[5]。末次给药30 min 后，各组小鼠按20 mL·kg-1体质量，用生理盐水灌胃，造成水负荷模型，实验开始时先轻压动物下腹，排尽余尿。分别收集小鼠1、2、3、4，5、6 h 的尿液，测定尿液体积，并将其冻存于-20℃冰箱中。

2.2 尿液中离子浓度的测定

用上述实验中的尿液作为样品，采用电解质分析仪分别检测小鼠尿液中的离子的浓度。

2.3 血清中糖原、尿素氮和肌酐的测定

用2.1 的方法给与小鼠药物，取血前小鼠禁食不禁水12 h，然后眼眶取血于1.5 mL离心管内，37℃温箱中静置约1 h，然后置于离心机内以3000 r·min-1离心15 min，用移液枪吸出分离的血清，置于4℃冰箱保存备用，采用全自动生化分析仪分别检测小鼠血清中糖原、尿素氮和肌酐的变化。

2.4 伞骨草对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响

取SPF级雄性KM小鼠60只，按体质量随机分为5组，每组12只，分别为：溶媒对照组（给予生理盐水，等容积）、阳性药物组（给药0.4 g·kg-1的阿司匹林）、伞骨草水提取物低剂量组（0.75 g·kg-1）、伞骨草水提取物中剂量组（1.5 g·kg-1）、伞骨草水提取物高剂量组（3.0 g·kg-1），每组灌胃给药，每天1 次，连续给药7 天，各组于末次给药60 min 后，将小鼠右侧耳廓涂抹二甲苯0.05 mL造致炎模型模，造模60 min 后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下双耳，用6 mm 打孔器分别在同一部位打下耳圆片，用分析天平称重。计算小鼠耳肿胀度和耳廓肿胀抑制率。公式如下：

小鼠耳肿胀度Δm=右耳片重量-左耳片重量

耳廓肿胀抑制率I（%）=（生理盐水组平均肿胀度- 给药组平均肿胀度）/生理盐水组平均肿胀度×100%。

2.5 伞骨草对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的影响

取SPF 级雄性SD 大鼠50 只，按体质量随机分为5组，每组10只，分别为：溶媒对照组（给予生理盐水，等容积）、阳性药物组(给药0.4 g·kg-1的阿司匹林)、伞骨草水提取物低剂量组（0.75 g·kg-1）、伞骨草水提取物中剂量组（1.5 g·kg-1）、伞骨草水提取物高剂量组（3.0 g·kg-1），每组灌胃给药，每天 1 次，连续给药 7 天，各组于末次给药60 min 后，给每只大鼠右后足趾皮下注射1%角叉菜胶 0.1 mL，于注射后0.5、1、2、4、6 h 分别测定各鼠右后足趾容积，比较各组大鼠致炎后不同时间右后足趾肿胀度和足趾肿胀抑制率。

足趾肿胀度Δm=致炎后足趾容积-致炎前足趾容积

足趾肿胀抑制率I（%）=（模型组平均足肿胀度-给药组平均足肿胀度）/模型组平均足肿胀度×100%。

2.6 急性毒性实验

图1 伞骨草各剂量组对小鼠排尿量影响（，n=12）

参考文献[13]方法，将70 只KM 小鼠随机分为7 组，即溶媒对照组(纯水)和伞骨草水提物17.30，14.71，12.49，10.62，9.03和7.67 g·kg-1剂量组，每组10只，雌雄各半。禁食不禁水约12 h后，各剂量组均以40 mL·kg-1灌胃给予伞骨草水提物不同浓度溶液1 次，阴性对照组同法给予纯水1 次。给药当天连续观察4 h 动物出现的各种毒性反应、症状及死亡情况，以后每天观察1次，连续14天;于给药第3、7、14天称量体质量；观察结束后处死动物，大体解剖观察各组动物脏器、器官的体积、颜色、质地等有无明显异常。采用Bliss 法计算伞骨草水提物小鼠急性毒性的LD50及95%可信限。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 伞骨草对小鼠尿液量的影响

伞骨草水提取物对KM 小鼠的排尿量的影响见图1。结果显示，与空白组比较，在1 h 内，伞骨草水提物低、中、高剂量组（0.75、1.5、3.0 g·kg-1）小鼠排尿量明显增加（P＜ 0.05、P＜ 0.01、P＜ 0.01）；在 2 h、3 h 内，中、高剂量组（1.5、3.0 g·kg-1）小鼠排尿量明显增加（P＜ 0.05、P＜ 0.01）；在4 h、5 h、6 h 内，中、高剂量组（1.5、3.0 g·kg-1）小鼠排尿量明显增加（P＜ 0.05、P＜0.05），实验结果表明，伞骨草水提物对能增加KM 小鼠的排尿量，且高剂量组效果最佳。

3.2 伞骨草对小鼠尿液中钾、钠、氯、钙离子浓度的影响

收集给药后6 h 的总尿液，对尿液中的离子浓度进行测定，结果显示，与对照组相比，阳性药能显著增加K+、Cl-和Ca2+的排出量（P＜ 0.01），显著增加Na+排出量（P＜ 0.05）；伞骨草低、中、高剂量能显著增加K+、Cl-的排出量（P＜0.01），；伞骨草高剂量能显著增加Na+、Ca2+的排出量（P＜0.05）；伞骨草各剂量对小鼠尿液的pH均无显著影响（P＞0.05）。说明伞骨草水提物在发挥利尿作用的同时，对K+、Na+、Cl-、Ca2+等离子浓度有一定的影响，其利尿作用可能与NaCl等电解质的重吸收有关，从而增加利尿作用（表1）。

3.3 伞骨草对小鼠血清中糖原、尿素氮、肌酐的影响

给药7 天后，对小鼠血清中糖原、尿素氮、肌酐进行检测，结果显示，与对照组相比，阳性药对小鼠血清中的糖原、尿素氮、肌酐均无明显影响（P＞0.05）；伞骨草低、中、高各剂量对小鼠血清中的糖原、尿素氮、肌酐均无明显影响（P＞0.05）。结果表明，伞骨草水提物在发挥利尿作用的同时，对糖原代谢和肾脏功能没有明显损伤，毒副作用较小（表2）。

表1 伞骨草各剂量对小鼠尿液离子浓度的影响（，n = 12）

表1 伞骨草各剂量对小鼠尿液离子浓度的影响（，n = 12）

注：与溶媒对照组相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

离子浓度/（mmol·L-1）Ca2+0.7±0.4 1.2±0.3**0.6±0.2 0.8±0.4 1.0±0.2*组别溶媒对照组呋塞米（10 mg·kg-1）伞骨草低（0.75 g·kg-1）伞骨草中（1.5 g·kg-1）伞骨草高（3.0 g·kg-1）pH 6.1±0.2 6.4±0.5 6.1±0.3 6.1±0.3 6.2±0.6 K+29.0±3.1 34.9±6.9**46.5±8.1**61.8±8.1**88.4±7.6**Na+81.3±27.3 107.7±17.9*82.0±24.4 93.0±20.9 107.2±18.4*Cl-128.0±9.9 106.4±7.4**208.3±39.3**369.2±51.0**802.8±133.1**

表2 伞骨草各剂量对小鼠血清中糖原、尿素氮、肌酐的影响（，n = 12）

表2 伞骨草各剂量对小鼠血清中糖原、尿素氮、肌酐的影响（，n = 12）

注：与溶媒对照组相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

肌酐/（ummol·L-1）15.48±4.43 18.96±7.11 16.42±5.11 12.29±4.75 12.89±3.64组别溶媒对照组呋塞米（10 mg·kg-1）伞骨草低（0.75 g·kg-1）伞骨草中（1.5 g·kg-1）伞骨草高（3.0 g·kg-1）糖原/（mmol·L-1）7.64±1.44 7.57±0.95 7.55±1.28 6.75±1.54 8.23±1.04尿素氮/（mmol·L-1）7.55±1.86 8.82±1.87 6.57±1.02 6.92±0.67 6.54±0.16

表3 伞骨草各剂量对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响（，n = 12）

表3 伞骨草各剂量对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响（，n = 12）

注：与溶媒对照组相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

肿胀抑制率/%-32.50 10.50 15.44 20.25组别溶媒对照组阿司匹林伞骨草低伞骨草中伞骨草高剂量/（g·kg-1）-0.4 0.75 1.5 3.0肿胀度13.33±1.63 9.00±2.79 11.93±2.02 11.28±2.50*10.63±2.24**

3.4 伞骨草对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

给药7 天后，对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀进行检测，结果显示，与溶媒对照组相比，伞骨草中剂量对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用（P＜0.05），伞骨草高剂量对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用（P＜ 0.01）（表3）。结果表明，伞骨草水提物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用。

3.5 伞骨草对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的影响

给药7 天后，对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀进行检测，结果显示，与溶媒对照组相比，伞骨草中剂量对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀具有明显的抑制作用（P＜0.05），伞骨草高剂量对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀具有明显的抑制作用（P＜0.05），与阳性药相比抑制效果稍弱；造模4 h后足趾肿胀度达到最大，6 h后足趾肿胀度开始下降（表4、表5）。结果表明，伞骨草水提物角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀具有明显的抑制作用。

3.6 急性毒性试验

伞骨草水提物24 h内小鼠单次灌胃给药急性毒性试验的LD50为：12.33 g·kg-（1相当于生药82.15 g·kg-1），为本次实验所用高、中、低剂量的4倍、8倍、16倍，95%的可信限为 11.90 g·kg-1-17.16 g·kg-1。给药后 15 min出现毒性反应。动物在4 h 内出现的毒性反应，主要表现为腹泻、俯卧、竖毛、运动失调、死亡（表6）。腹泻至给药第2 天恢复，死亡小鼠解剖情况：肺充血。给药后第3、7、14天给小鼠称重，各组小鼠体质量均持续增长，与溶媒对照组比较，伞骨草水提物组小鼠体质量均无显著性差异（P＞0.05），结果见表7。试验结束后对存活动物进行大体解剖观察，除伞骨草水提物组有7 只小鼠子宫充血外，其余小鼠脏器、器官的体积、颜色、质地等均未见明显异常。据毒性反应结果推测其毒性可能涉及的组织、器官、系统为中枢神经、神经肌肉、自主经和胃肠道的损伤。

4 讨论

利尿药一直作为一线降压药治疗高血压，主要通过增加肾脏对电解质及水的排出发挥作用[14-16]。炎症是机体对损伤因子所产生的正常防御反应过程，一些抗炎药物，如非甾体抗炎药、抗生素、维生素等均可以有效治疗炎症及其并发症，但是类似西药通常会带来一些副作用[17]。传统中药通过调节患者自身的免疫情况在治疗高血压和炎症等方面取得了显著的效果。《滇南本草》[11]中记载伞骨草气具有利水通淋的作用，在云南民间用水煎治疗水肿胀和炎症等症状。为了进一步开发利用本植物，我们提取伞骨草并进行利尿、抗炎活性和急性毒性研究。

尿液量的排除可以直接反应药物是否具有利尿作用[18]，从图1 可以看出，伞骨草水提物可明显增加小鼠的排尿量，且高剂量的伞骨草水提物效果最佳。尿液离子可以反应机体电解质的状态，也可以一定程度上说明药物利尿的作用机制。呋塞米属于髓袢利尿药可能通过特异性抑制髓袢升支的Na+/K+/2Cl-共同转运体和远曲小管的Na+/Cl-共同转运体[19，20]，选择性抑制NaCl的重吸收、降低肾的尿浓缩功能达到利尿的效果。表1 结果提示，各剂量伞骨草给药组小鼠的尿液中 Na+、K+、Cl-和Ca2+的浓度均有不同程度的升高，且存在一定的量-效关系，推测伞骨草可能选择性抑制Na+、K+、Cl-和Ca2+离子的重吸收，增加 Na+、K+、Cl-和Ca2+的排泄从而达到利尿的效果。

表4 伞骨草对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀抑制作用（，n = 10）

表4 伞骨草对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀抑制作用（，n = 10）

注：与溶媒对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

组别溶媒对照组阿司匹林伞骨草低伞骨草中伞骨草高肿胀度/μL 6 h 2154.8±74.1 1458±33.2**2050±80.3 1895±63.2*1643±50.2**剂量/（g·kg-1）-0.4 0.75 1.5 3.0 0.5 h 1580±50.1 1023±42.3**1405±70.2 1301±52.1*1195±45.2**1 h 1667±52.1 1098±42.8**1580±58.2 1390±48.2*1290±48.2**2 h 2024±57.3 1302±52.8**1892±80.9 1742±60.3*1514±53.2**4 h 2533±60.6 1680±45.4**2520±71.3 2302±61.0*2033±60.2**

表5 伞骨草对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀抑制作用（，n = 10）

表5 伞骨草对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀抑制作用（，n = 10）

组别溶媒对照组阿司匹林伞骨草低伞骨草中伞骨草高剂量/（g·kg-1）-0.4 0.75 1.5 3.0 0.5 h-35.25 11.08 17.66 24.37肿胀度抑制率/%1 h-34.13 5.22 16.62 22.62 2 h-35.67 6.52 13.93 25.20 4 h-33.68 0.51 9.12 19.74 6 h-32.34 4.86 12.06 23.75

表6 伞骨草提取物小鼠急性毒性实验毒性反应（n = 10）

糖原是由葡萄糖分子通过糖苷键聚合而成的高分子物质，作为重要的能源物质储存于肝脏、肌肉和脑等重要器官，在体内异常会对机体造成伤害，糖原检测对某些疾病的的诊断具有重要的意义[21]。表2 中显示伞骨草对小鼠血清中的糖原代谢无明显影响。

表7 伞骨草提取物小鼠急性毒性实验动物体质量（♀/♂，n =10）

尿素氮和肌酐是人体内代谢的主要产物，主要由肾小球滤过排出体外。尿素氮和血肌酐是肾功能的两个最重要的指标[14,22]。为考察伞骨草水提物在发挥利尿作用的同时是否对肾脏功能造成影响，我们检测了小鼠血清尿素氮、肌酐，结果显示尿素氮、肌酐水平没有显著变化，提示伞骨草在发挥利尿作用的同时对肾脏功能没有明显损伤。

炎症是机体受到各种损伤因子刺激后，血管系统的活体组织产生的防御反应，病理过程是炎症区组织渗出、变性、增生，临床表现为红肿热痛和机能障碍[8，9]。二甲苯和角叉菜胶均能使机体产生炎症，通过二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀实验发现，伞骨草均具有明显的抗炎作用，并且随着剂量的提高其抗炎效果明显增加，具有一定的剂量依赖性。

综上所述，伞骨草具有利尿和抗炎的活性，其利尿的主要机制应该与K+、Cl-、Ca2+排出量有关，然而伞骨草对小鼠的糖原合成和肾脏功能没有明显影响，伞骨草中主要活性物质将进一步研究。