扶正消瘤颗粒对原发性肝癌血清中VEGF、HIF-1α表达的影响及临床意义＊

陈晓琦，张鹏鸽，陈新蕊，冀爱英，吕 转，赵云霞，陈欣菊，邵明义＊＊

（1. 河南中医药大学第一附属医院消化科 郑州 450000；2. 河南中医药大学第一临床医学院郑州 450000；3. 河南中医药大学第一附属医院行政科 郑州 450000）

原发性肝癌（Primary hepatocellular carcinoma，PHC，简称肝癌）是指原发在肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，其中肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的类型。肝癌因其生长快、易复发、生存期短等特性一直位居我国肿瘤致死原因的前3 位，所以对于肝癌的治疗应不断探索并创新，以求取得突破性进展。TACE 是目前肝癌最常用的非手术方式之一，适于肝功能较好、瘤体血供丰富或因其他原因不愿接受手术切除术的患者。研究表明，经导管动脉化疗栓塞术（Transcatheter arterial chemoembolization，TACE）在延缓肿瘤进展、延长生存时间方面有显著作用。这种治疗手段与肝癌的新生血管生成密切相关，我们以此来探讨肝癌的微血管生成机制和药物的临床疗效。

血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是人体内微血管生成的核心因子，正常成人体内含量较低，但当人体由于实体瘤或其他原因造成局部缺氧微环境时，两者表达水平升高，这是因为HIF-1α 在低氧条件下仍具有转录活性，而且能调控VEGF的基因转录与表达。以往大量的动物实验和临床研究表明，实体肿瘤早期，瘤内细胞的缺氧环境可导致HIF-1α 在肿瘤组织和外周血中的表达呈上升趋势，VEGF 作为HIF-1α 的下游靶蛋白也随之表达增加，VEGF 能促进瘤体的微血管生成、改善瘤体边缘的细胞能量代谢，从而促进肿瘤的发展、侵袭和转移。

本研究团队自2010 年开始采用TACE、射频消融术（Radio Frequency Ablation，RFA）、碘粒子植入等多种微创技术联合治疗肝癌的同时，更着重于观察中医药对肝癌患者的影响。本团队认为正气和邪气不断斗争导致邪盛正虚，引起了肝癌的发生，其中的邪气包括气滞、血瘀、湿热、痰浊等，且各种邪气之间彼此影响、互相加重，所以临床中患者证型并不单一存在，而研究发现［1］，化疗栓塞治疗后中医证型多集中于脾虚湿盛、血瘀、湿热。在此理论基础上，以“扶正祛邪”为总的治疗原则，针对微创术后最常见的中医证型创制扶正消瘤方，功可疏肝健脾，清热化痰，软坚散结，祛瘀止痛，适用于本研究中的所有患者。本研究团队经多年的临床观察及研究［2-4］发现扶正消瘤方在诱导细胞凋亡、改善临床症状、提高生活质量、控制病情发展等方面有其独特优势。虽然中医药对肝癌症状的改善方面有明显优势，但中医药与血管生成分子水平的关系研究仍比较缺乏。

基于前人对血管生成的研究成果，本研究通过测定原发性肝癌患者在不同因素干预情况下、不同时间点的血清中VEGF、HIF-1α 水平、治疗前后生活质量评分的变化情况以及血清中VEGF、HIF-1α 水平与生活质量的相关性，进一步明确肝癌血管生成的机制，探讨中医药对肝癌抗血管生成、改善患者生活质量等方面的作用，为中医药治疗肝癌提供新思路与理论依据。

1 病例来源与标准

1.1 病例来源

河南中医药大学第一附属医院消化科2018 年1月至2018 年12 月入院，确诊为原发性肝细胞癌（HCC，以下简称肝癌）的患者66例。采用随机对照研究方法，将66 例研究对象分为对照组和试验组，每组33例。

1.2 病例选择标准

①符合原发性肝癌诊断标准；②肝功能Child-Pugh 分级 A 级或 B 级，肝癌分期为Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa期；③年龄在18 岁-75 岁（含18，75 岁）之间，性别不限；④预计生存期在6个月以上；⑤符合TACE、RFA等治疗适应症；⑥自愿参加本研究，依从性好，签署知情同意书。

1.3 排除标准

①有严重黄疸、腹水、全身广泛转移等微创治疗绝对禁忌症者；②较大肿瘤突出于肝脏表面，靠近胆囊、肝门部及胃肠道的肿瘤；③合并心、脑、肺、肾、造血系统等严重原发性疾病；④妊娠期或哺乳期妇女；⑤呕吐频繁或厌服中药者；⑥过敏体质，对多种药物有过敏史者；⑦近1 月内接受过手术、微创等治疗，或服用其他中药抗癌制剂或免疫调节剂的患者；⑧3 个月内参加过或正在参加其他临床试验者。

1.4 剔除、脱落标准

①受试者依从性差，未能规律配合用药，或中途停止治疗而无法判断疗效者；②患者治疗过程中病情恶化，不能继续治疗或死亡者；③发生严重的不良事件，不宜继续临床试验者；④观察过程中自然脱落、失访者；⑤临床资料或实验室数据不全，导致无法判定疗效者；⑥受试过程中或随访观察期间，服用了影响试验结果的药物；⑦患者治疗过程中要求中止进行本临床试验研究或改用其他治疗方法的。

2 方法

2.1 治疗分组

对照组：TACE 序贯RFA + 西医基础治疗（抗病毒、保肝降酶、对症支持等）；

试验组：扶正消瘤颗粒（组成：黄芪30 g、菝葜30 g、党参15 g、白术15 g、白芍15 g、丹参30 g、鳖甲20 g、牡蛎30 g、人参30 g、陈皮12 g、柴胡10 g、甘草6 g（江阴天江药业有限公司制备颗粒剂）；用法：冲服，每日1剂，早晚温服，每次200 mL）+TACE 序贯RFA + 西医基础治疗；

治疗过程：3 个月为1 个疗程。分别于TACE 前1天、TACE 后 1 天、TACE 后 1 周（即 RFA 后）、TACE 后 1月、TACE 后3 月（下文中各时间点可简称为术前1 天、术后 1 天、术后 1 周、术后 1 月、术后 3 月。）采集患者外周血3-5 mL，常温下静置1 h，然后置于离心机，以3000 r·min-1的转速离心10 min，取上层血清置于-80℃冰箱中保存待检。避免反复冻融。抽取血样标本过程均取得患者的知情同意。

2.2 试剂盒

测定血清VEGF 和HIF-1α 的试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司。

2.3 测定过程（VEGF和HIF-1α相同）

取出待测血清室温下解冻；在酶标板上设置8 个标准孔，每孔中按使用说明配制可用浓度的标准品50 μL；设置样本孔和空白对照孔；密封后置入37℃恒温箱温育30 min；然后洗涤、加酶、显色，终止后用酶标仪450 nm 波长测定吸光度（即OD 值），再计算样本相应浓度。

3 统计学方法

采用SPSS23.0 软件对本研究数据进行统计学分析，计量资料用均数± 标准差表示。比较VEGF 和HIF-1α 不同时期浓度变化、VEGF 和 HIF-1α 表达与临床分期的相关性用单因素方差分析，比较两因子表达趋势与中药干预的相关性用重复测量数据的方差分析，VEGF 和HIF-1α 表达水平的相关性用Pearson相关性分析。基线资料中计量资料用单因素方差分析，计数资料用卡方检验或Fisher 确切概率法。P＜0.05认为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 基线资料比较

纳入对象一共66 例，其中男性54 例，女性12 例；年龄最大 74 岁，最小37 岁，平均年龄 57.35 ± 9.98 岁；在合并乙型肝炎、Child-Pugh 分级、AFP 值、临床分期方面试验组和对照组差异无统计学意义（P＞0.05），两组有可比性（表1）。

4.2 VEGF和HIF-1α的相关性

本研究把所有纳入对象（不论术前还是术后各个时间点）的血清VEGF、HIF-1α 水平进行Pearson 相关性分析发现，VEGF 和HIF-1α 水平呈线性正相关（r=0.829，P＜ 0.001）（图1）。

表1 基线资料情况比较

图1 本研究中VEGF和HIF-1α的相关性

4.3 不同时期VEGF、HIF-1α水平变化

分析各个时间点 VEGF、HIF-1α 水平变化时，考虑到对照组未使用扶正消瘤颗粒，微创治疗中的影响因素只有时间点不同，所以分析对照组可以明确TACE 序贯 RFA 治疗对 VEGF、HIF-1α 水平的影响。对照组患者血清中VEGF 水平随时间递推，TACE 后1天较术前1 天明显升高，后逐渐下降（P＜ 0.05），TACE后1、3 月间无明显差异，均降至术前水平（P＞ 0.05）。HIF-1α 水平随时间递推，TACE 后1天明显升高，后逐渐下降（P＜ 0.05），但TACE 后3 月仍高于术前（P＜0.05）（表2）。

4.4 扶正消瘤颗粒对VEGF、HIF-1α的影响

试验组不同时期VEGF、HIF-1α 两因子水平变化：VEGF 水平随时间递推，TACE 后1天较术前1天明显升高，后逐渐下降（P＜ 0.05），TACE后1月、3月间无明显差异，均降至术前水平（P＞ 0.05）。HIF-1α 水平随时间递推，TACE 后1 天较术前1 天明显升高，后逐渐下降（P＜ 0.05），TACE 后3 月降至术前水平（P＞0.05）（表3）。

表2 本研究中对照组不同时期VEGF、HIF-1α浓度变化

表3 本研究中试验组不同时期VEGF、HIF-1α浓度变化

表4 本研究中试验组和对照组不同时期VEGF、HIF-1α浓度变化比较

试验组与对照组之间比较，用重复测量资料方差分析。①VEGF：试验组与对照组相比，术前1 天、TACE 后1 天两组间无明显差异（P＞ 0.05），TACE 后1周、1月、3月两组间差异有统计学意义（P＜ 0.05）。②HIF-1α：试验组与对照组相比，术前1天、TACE后1天两组间无明显差异（P＞ 0.05），TACE 后1 周、1 月、3 月两组间差异有统计学意义（P＜ 0.05）（表4）。

4.5 扶正消瘤颗粒对生活质量评分的影响

参照2001 年由万崇华等编制的肝癌患者生命质量测定量表QOL-LC（V2.0）评分标准对入选的患者进行生活质量评分，测定治疗前后两组患者躯体功能、心理功能、症状/副作用、社会功能领域及生活质量总评分变化：试验组治疗后患者生活质量四个领域评分及总评分较治疗前均升高（P＜0.05）。对照组治疗后生活质量总评分及躯体功能、症状/副作用、心理功能领域评分较治疗前均升高（P＜0.05），而社会功能领域评分治疗前后差异无统计学意义（P＞0.05）（表5）。

4.6 血清中VEGF、HIF-1α 水平与生活质量相关性分析

治疗前两组患者血清总VEGF、HIF-1α 水平均服从正态分布，提示VEGF 与生活质量总评分间未存在显著的相关关系，HIF-1α 与生活质量总评分间存在正向相关关系（表6、图2、图3）。

表5 治疗前后两组生活质量比较（）

表5 治疗前后两组生活质量比较（）

注：①与对照组治疗前相比P 值；②与治疗前组内相比P 值；③与治疗前组内相比P值。

领域躯体功能P 0.000 0.017 0.001 0.041 0.000 0.005 0.006 0.093 0.000 0.000心理功能症状/副作用社会功能生活质量总评分组别试验组对照组试验组对照组试验组对照组试验组对照组试验组对照组治疗前31.4±4.4①30.8±3.5 29.9±4.8①30.3±5.1 28.8±4.6①31.0±3.5 27.4±5.3①29.1±4.1 125.0±17.4①124.9±16.9治疗后35.3±4.9②31.7±4.1②31.5±5.2②31.5±3.8②32.7±5.1②31.1±4.3②28.9±4.8②29.1±3.2③136.9±18.1②128.0±15.8②

表6 血清VEGF、HIF-1α水平与生活质量总评分相关性

图2 血清VEGF水平与生活质量总评分关系

图3 血清HIF-1α水平与生活质量总评分关系

5 讨论

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率均占全球的50.0%以上［5］。临床中肝癌治疗包括手术切除、肝移植、介入、靶向治疗、免疫治疗、放化疗、中医药治疗等。

VEGF 能特异性调控肝癌组织的血管新生。在VEGF/血管内皮细胞生长因子受体（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR）通路中，肿瘤细胞以旁分泌的形式使VEGF与肿瘤血管内皮细胞分泌的VEGFR 特异性结合形成二聚体后，增加血管通透性，促进内皮细胞增殖、迁移，使大量新生微血管生成并引起肿瘤远处转移［6］。HIF-1α 参与肿瘤糖酵解、血管生成、增殖与凋亡、侵袭转移、微环境pH 调节等过程［7-9］。通过对小鼠肝癌细胞的培养，李伟等［10］明确了缺氧条件可诱导肝癌组织HIF-1α的高表达。

TACE后肿瘤组织局部缺血、缺氧，VEGF、HIF-1α的表达增多，TACE 术后造成瘤体局部急性缺氧，HIF-1α 高表达且性质稳定，可直接上调VEGF 的表达，促进新生血管生成，触发不完全肿瘤坏死，促进肿瘤的复发和转移［11］。相关研究显示，TACE 术后 VEGF、HIF-1α 的表达高峰出现在术后1-7 天，此后逐渐下降，且治疗后疾病稳定时VEGF、HIF-1α 水平与患者的临床疗效、复发情况存在相关性［12-16］。RFA 对血清VEGF 和HIF-1α 水平的影响并不明确，但在提高免疫力、减少并发症方面有明显作用［17］。本研究采用TACE 联合RFA 的手段来彻底破坏影像学可见的肿瘤组织，以期达到临床缓解率最大化的目的，进而观察血清VEGF和HIF-1α水平的动态变化。

祖国医学认为肝癌的发病无外乎正虚邪盛，所谓“正气存内，邪不可干”，治疗上总体以扶助正气、祛除毒邪、消除癌癥为治疗目的，祛邪兼顾扶正，正气不虚，则祛邪效果更强。扶正消瘤颗粒的方药组成：黄芪、菝葜、党参、白术、白芍、丹参、鳖甲、牡蛎、猫人参、陈皮、柴胡、甘草，主要功效为益气疏肝健脾，清热化痰，软坚散结，祛瘀止痛。在改善临床症状、减少术后并发症、延长生存期等方面效果显著。

本研究中患者采用了TACE 序贯RFA 治疗，中医认为，此期患者正虚邪实，扶正消瘤颗粒在扶正的同时兼顾祛邪。研究整个治疗过程中TACE 能加重肿瘤组织缺氧，血管新生增多，RFA 后缺氧情况稍改善，后缺氧情况逐渐缓解，新生血管数量也随之减少。但这并不能说明RFA 能改善缺氧环境，可能与TACE 后阻断了肿瘤组织的获能途径，肿瘤细胞大量死亡而数量减少，耗能逐渐减少相关。通过扶正消瘤颗粒用药后观察，试验组两因子水平明显比对照组下降速度快，说明长期服用中药扶正消瘤颗粒可以改善肝癌组织缺氧情况，抑制肿瘤血管新生，降低转移的可能性。本研究还发现，除社会功能外，治疗组在改善肝癌患者生活质量方面均优于试验组，提示在一定程度上扶正消瘤颗粒可减轻患者乏力、疼痛、腹胀、腹泻等不良症状，提高肝癌TACE联合RFA术后患者的生活质量。相关性分析表明血清中VEGF水平与肝癌患者生活质量无明显相关，不排除因样本量较小，导致数据的偏差，本团队将在下一步的研究中进一步扩大样本量。HIF-1α 水平与肝癌患者生活质量呈正相关，这可能与HIF-1α 的双向调节作用相关[18]，血清中的高HIF-1α水平可应激性的启动机体保护机制，增强肝癌患者免疫力，降低不良反应，提高生活质量。

本研究证实在肝癌的血管生成关系中，HIF-1α能调控VEGF的表达，两者呈正相关关系，同时扶正消瘤颗粒可以明显改善TACE联合RFA治疗中肝癌组织的缺氧情况，降低HIF-1α水平，下调VEGF的表达，抑制肿瘤血管生成。对以后中医药辅助治疗肝癌提供了有力的证据。