基于网络药理学的升陷汤治疗心力衰竭的作用机制研究＊

曲 艺 ，但文超 ，刘金垒 ，崔向宁

（1. 北京中医药大学研究生院 北京 100029；2. 中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

心力衰竭，简称心衰（heart failure，HF）是多种原因导致心脏结构和（或）功能的异常改变，使心室收缩和（或）舒张功能发生障碍，从而引起的一组复杂临床综合征，是多种心脏疾病的严重表现或终末阶段[1]。流行病学调查显示，该病好发于65岁以上的人群[2]，死亡率和再住院率居高不下[3，4]，造成巨大的经济负担[5]。近年来，现代医学在心力衰竭防治中取得显著进展，然而在利尿剂抵抗、心衰反复住院、生活质量下降等方面尚缺乏理想的治疗对策[6]，面对这些问题，中医药凭借其多方位、多靶点、多机制，毒副作用小等特点，在治疗心力衰竭中有显著优势和广阔前景[7]。

临床研究显示，以升陷汤为基础方治疗心力衰竭，可明显改善患者的临床症状和心功能情况[8-12]。网络药理学结合系统生物学与计算机技术，基于“疾病-基因-靶点-药物”互作网络，揭示多分子药物对疾病网络的干预与影响，这与中药复方多成分、多靶点的作用机制殊途同归，十分符合中医整体观与辩证论治的原则[13]。本研究借助中药复方网络药理学的方法，分析升陷汤的有效活性成分及其潜在作用靶点，以探讨其治疗心衰的作用机制，为今后的药理学及临床研究提供借鉴。

1 资料与方法

1.1 升陷汤中活性成分的筛选和靶点预测

由于现存公开数据库的信息有限、各有优势，为保证数据的全面性与准确性，故选取TCMSP[14]、TCMMESH[15]、化学专业数据库[16]、ETCM[17]多个数据库，分别以黄芪、升麻、柴胡、知母、桔梗为关键词检索获取升陷汤的活性成分，并进行整合与去重；筛选活性成分条件为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥ 0.18[18]；根据已有文献报道整理出升陷汤各味中药治疗心力衰竭的有效成分，对预测结果进行补充。运用TCMSP靶点预测模型对活性成分的作用靶点进行预测。

表1 升陷汤活性成分

1.2 构建升陷汤“活性成分-靶点”网络

使用软件Cytoscape 3.7.1[19]来构建升陷汤“活性成分-靶点”网络，其中用“节点”（node）表示成分或靶点，用“边”（edge）表示二者之间的关系；使用Network Analyzer 分析工具分析网络特征，包括连接度（degree）、介度（betweenness）及紧密度（closenesss）等，以研究活性成分与靶点及其之间的关系。

1.3 心力衰竭相关靶点检索

利用“heart failure”为关键词，在 Genecards[20]、OMIM[21]、Disgenet[22]、DigSee[23]等疾病基因数据库进行检索与筛选，将结果合并后删除重复值，再根据文献报道补充未预测到的活性成分的已知靶点，并利用Uniprot数据库将所得靶点进行统一规范。

1.4 蛋白质互作网络构建及关键靶点筛选

利用BisoGenet 构建蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络。将升陷汤活性成分靶点与心力衰竭靶点分别导入BisoGenet 内，各自生成1 个PPI 网络，通过Cytoscape中的Merge功能提取2个PPI网络的交集网络，利用CytoNCA[24]分析交集网络中各个节点的属性值。计算交集PPI的网络拓扑学特征属性值并对结果进行筛选，从而得到关键靶点。

1.5 通路富集分析

Metascape平台整合多个权威数据库，支持对批量基因或蛋白质进行注释、富集分析及构建PPI网络，功能强大、更新及时、数据可靠。将筛选后的靶点导入Metascape 平台进行GO 及KEGG 分析，保存其结果并通过R软件进行可视化。

2 结果

2.1 升陷汤活性成分及靶点获取

从TCMSP 数据库初步获取升陷汤成分806 个，通过OB 和DL 参数筛选并根据文献报道补充[25-30]后，获得60个活性成分（表1）。将靶点预测结果合并后排除重复值，共获得156个靶点。

图1 升陷汤活性成分-靶点网络图

2.2 升陷汤“活性成分-靶点”网络构建和分析

利用Cytoscape 3.7.1 对升陷汤活性成分及其作用靶点的关系网络进行绘制和分析，共获得216 个节点（包含156 个靶点和60 个活性成分）与757 条关系，结果见图1。

2.3 心力衰竭相关靶点检索

检索 Genecards、OMIM、Disgenet、DigSee 疾病数据库，得到心力衰竭靶点个数分别为8233（经筛选后为1324）、23、74、22，筛选并去除重复值后得到靶点1387个。药物靶点与疾病靶点交集为50个（图2）。

2.4 升陷汤治疗心力衰竭的PPI 网络构建与关键靶点筛选

2.4.1 升陷汤治疗心力衰竭的PPI网络绘制

图2 药物靶点和疾病靶点分布图

运用Cytoscape分别构建升陷汤与心力衰竭的PPI网络，结果显示：升陷汤潜在靶点可与6861 个靶点产生直接或间接作用，其相互关系可达151106 种；与心力衰竭直接或者间接相关的靶点有11469 个，靶点间相互联系可达232187种，二者交集网络图见图3。

2.4.2 升陷汤治疗心力衰竭关键靶点筛选

图4 关键节点的筛选策略图

图5 升陷汤核心靶点相互作用网络

图6 升陷汤治疗心力衰竭核心PPI网络内部潜在module网络

图7 升陷汤治疗心力衰竭核心PPI网络内部潜在module网络功能描述

计算交集PPI的网络拓扑学特征属性值后，进行2次筛选，共获得关键靶点197个，具体筛选策略见图4，最终结果见图5。

通过分子复合物检测算法对相互作用关系进行分析，得到module（图6）。对module 中生物学进程对其进行功能描述（图7）。

2.5 升陷汤治疗心力衰竭通路富集分析可视化

利用Metascape 平台对上述197 个关键节点进行基因富集分析，包括 GO 的 BP（biological process）、CC（cellular component）、MF（molecular function）以 及KEGG 通路，保存其结果，并选取Log10（P）值排名前20的结果将其进行可视化。将BP、CC、MF 结果绘制条形图（图8），气泡颜色由紫到黄代表Log10（P）值从小到大，横轴代表关键节点的数量；将KEGG通路结果使用R 语言绘制气泡图，结果见图9，气泡颜色由红到紫代表Log10（P）值从小到大，气泡面积代表该通路的基因计数，横轴代表该通路基因占所有基因的比率。

3 讨论

图8 升陷汤治疗心力衰竭作用靶点富集条形图

中医理论中，心衰病的病性为本虚标实，本虚以气虚为主，标实以血瘀为主。自古有“宗心肺而主燮理、贯心脉而行气血”等理论，因此宗气理论在心衰病的论治中有着重要地位。升陷汤出自张锡纯《医学衷中参西录》，药物为黄芪、升麻、柴胡、知母、桔梗，为治疗胸中大气下陷证的代表方。药理实验研究表明，黄芪注射液具有正性肌力作用，其保护心肌的作用可能是通过稳定细胞膜、保护线粒体和溶酶体来实现的[31]。柴胡通过影响慢性心力衰竭大鼠体内肉碱、长链脂肪酸的含量，来改善心血管系统的功能[32]。桔梗根部水提取物可以显著抑制细胞内ROS 的产生和NF-κB 的活化，参与多种促炎介质的调节[33，34]，进而影响心衰进程。临床观察显示，升陷汤能改善慢性心衰患者的心功能与生活质量，是一种安全有效的治疗策略[8]，对于气虚血瘀、水饮内停、心肺气虚等多种证型均有显著的治疗作用[9-12]。此外，有Meta 分析结果显示，升陷汤结合西药治疗优于西药组，且尚未出现严重不良反应[35]。

图9 升陷汤治疗心力衰竭通路富集气泡图

3.1 药物活性成分分析

由图1 和表1 可知，升陷汤治疗心力衰竭的主要成分可能为：槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、黄 芪 多 糖（astragalus polysaccharide）、黄 芪 甲 苷（astragaloside）等。槲皮素是一种类黄酮，存在于多种植物体内，升陷汤中的柴胡、黄芪都含有此种成分，具有显著的心脏相关益处，如抑制LDL 氧化、内皮依赖性血管舒张作用、内皮保护作用、预防神经元的氧化和炎性损害以及抗血小板凝集等[36]。山奈酚同时存在于柴胡、黄芪、知母中，能够通过降低血管紧张素II 或TGF-β 诱导的EMT 抑制心脏成纤维细胞的增殖和活化[37]，并且通过调节ASK1/MAPK 信号通路和氧化应激来预防心脏肥大，具体作用机制包括减少ROS 的产生、维持线粒体膜电位、减少细胞色素C 的释放等[38]。黄芪多糖有抗缺氧作用，通过扩张冠状动脉、增强心肌细胞的收缩来改善心力衰竭[39]；黄芪甲苷通过维持受损心肌细胞MMP 的稳定性、提高端粒活性、改善能量代谢与心肌供血，来抑制心肌细胞凋亡[40]。柴胡的活性成分含柴胡多糖、类黄酮等，其中柴胡多糖可诱导血管内皮细胞增强NO 的表达，从而松弛血管平滑肌、改善血流，类黄酮可增强毛细管功能[30]。

3.2 关键靶点结果分析

本研究经筛选后共得出197个潜在关键靶点。根据degree 值排名，其中较为重要的为TP53（肿瘤蛋白P53）、ESR1（雌激素受体）、FN1（纤连蛋白1）、UBC（泛素C）、TNF-α（肿瘤坏死因子）。研究表明，TP53 的表达增加与心力衰竭中凋亡引起的心肌细胞进行性丧失有关[41]。TP53 是凋亡相关基因的转录调节因子，通过下调抗凋亡基因产物Bcl-2，上调促凋亡基因产物Bax 等途径来参与凋亡过程的调控。ESR 在心肌肥厚及心力衰竭过程中亦起重要作用，可能是通过抑制TNF-α的表达、激活Akt 引起心肌细胞凋亡来实现的[42]。ESR1还与NF-κB协同作用，具有抗心脏或血管损伤的作用[43]。纤连蛋白是细胞外基质的关键成分，在心衰时会在组织中上调。白细胞介素是一种促炎和促肥大的细胞因子，可通过NF-κB 激活FN1，促进其在心脏成纤维细胞中的表达[44]。泛素可通过调节MMP 的表达或成纤维细胞增殖来减少心肌纤维化[45]，而UBC 在维持泛素稳态中起着关键作用[46]。研究表明，炎性细胞因子的过多或者不足，均可导致心力衰竭患者血流动力学的紊乱加剧，从而导致心肌重构，加重心衰[47]。TNF-α通过蛋白酶途径刺激细胞凋亡，诱导基础代谢的增加[48]；还通过补体途径，激活细胞毒性机制诱导心肌坏死[49]；此外TNF-α升高会引起过度的局部炎症反应，导致急性心肌破裂和慢性左心室功能障碍[50]。在动物模型中，TNF-α的心脏特异性过度表达导致扩张型心肌病的发展[51]。

3.3 通路与生物进程分析

本研究共获得KEGG 通路157 条，富集结果显示，升陷汤治疗心力衰竭主要涉及以下几个信号通路：PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、TLR 通路、HIF-1α信号通路、FoxO信号通路、细胞周期信号通路等。

P13K-Akt通路参与细胞的增殖调控，在促进细胞生长、抑制细胞凋亡方面起重要作用。体内外研究表明，其与心力衰竭的发生发展相关[52，53]。PI3K 的激活导致Akt 的募集和磷酸化，通过抑制促凋亡蛋白或转录因子实现信号调节[54]，从而减少心肌细胞凋亡。MAPK 通路通过抑制内质网应激来调节心肌细胞凋亡，JNK和p38/MAPK是其关键因子[55]。在右心室的成纤维细胞中，p38/MAPK 抑制作用可减少胶原蛋白和应激纤维的形成，并通过减弱MRTF-A 转运来阻止其分化为成肌纤维细胞[56]。此外，p38/MAPK通路在细胞自噬的调控过程中发挥着双重作用[57]，JNK 通过促进细胞内 Bcl-2 和 Bcl-XL 的磷酸化、释放 Beclin-1 刺激细胞自噬[58]。TLR 通路可继发于NF-κB，导致活化和促炎症细胞因子表达增加，引起心脏重塑、心肌细胞收缩力下降，从而加重心力衰竭[59]。值得注意的是，TLR 的急性激活短期有益，但是持续组织损伤所导致的慢性激活亦会引发心力衰竭[60]。HIF-1α通路在重塑心肌代谢中起关键作用[61]，缺氧和缺血条件下，HIF-1α可激活血管生成和血管重塑，抑制耗氧过程、促进氧气输送和厌氧过程，使细胞适应新的低氧环境。实验表明HIF-1α可改善缺血再灌注后左心室功能[62]。FoxO 通路在细胞的生长代谢、增殖分化、免疫衰老等方面均起重要作用[63]，其中FoxO3 在心脏中表达最丰富，作用最广：可抑制氧化应激来维持线粒体稳态[64-66]，通过钙调神经磷酸酶/NFAT、ROS、IGF-1 抑制心肌细胞生长[67]，抑制心脏成纤维细胞增生和基质沉积，还可促进自噬、抑制肥大、抑制凋亡和坏死[68，69]。此外，FoxO1 调节新陈代谢和抗氧化反应，FoxO4 可调节炎症反应，均在心脏中起着重要作用[70]。

综上所述，升陷汤治疗心力衰竭的主要成分可能是槲皮素、山奈酚、黄芪多糖、黄芪甲苷等，涉及到的关键通路有PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、TLR通路、HIF-1α信号通路、FoxO 信号通路、细胞周期信号通路等，与细胞周期、细胞凋亡、自噬、氧化应激、炎症反应等多个生物学过程相关。中医网络药理学方法促进了中医从经验医学到循证医学的转化，有助于阐释中药复方的组合规则和网络调节效果，并为药物研发策略提供思路[71]。本研究尚存在以下局限性：网络药理学受限于已有的数据库和实验数据，而大多实验存在一定的假阳性率和假阴性率，故数据仅能接近但无法真实反映全部的细胞网络[72]；中药在煎煮时会发生复杂的化学反应，本研究未将升陷汤煎煮后的化学成分以及药物在体内的代谢物纳入分析。后续将继续关注此领域的相关进展，并进一步对筛选出的靶点进行实验验证。