基于血清代谢组学技术考察通阳化浊方与四妙勇安汤治疗冠心病模型家兔的作用机制＊

2020-04-06梁丽喆胡镜清

世界科学技术-中医药现代化 2020年10期

梁丽喆，胡镜清，吴怡

（1. 辽宁中医药大学附属第二医院沈阳 110034；2. 中国中医科学院中医基础理论研究所北京 100700）

冠心病全名为冠状动脉粥样硬化性心脏病，是冠状动脉因为粥样硬化的器质性改变导致管腔狭窄或阻塞，和（或）因功能性改变导致心肌缺氧缺血或坏死，从而引起的一类心脏疾病的统称[1]。近年来，城市人群中冠心病患病人数和住院人数已上升至内科疾病的首位[2]。目前，对于冠心病预防和治疗的手段仍以药物干预为主，研究中药在冠心病治疗中的作用机制，能够更好的为日后的药理学研究、冠心病临床治疗以及药物研发提供参考[3]。

文献整理结果表明，冠心病的现代机制研究多以内皮反应损伤学说立论，而中医药多从“痰”“瘀”“热”等常见证型入手，进行辨证论治[4-6]。胡镜清教授在病机兼化的理论框架下，提出的冠心病“早期湿化、中期热化、晚期虚化”的病机，为该病的诊疗提供了新思路。本研究依托博士后和国家人才项目基金，在前期研究中，初步验证了清热解毒类中药与化痰祛瘀类中药在冠心病（高脂合并血管内皮损伤）模型中的降血脂、抗氧化等疗效。本文通过血清代谢组学技术，再次将化湿类临床验方通阳化浊方与清热解毒类经方四妙勇安汤作对比，探讨两种临床疗效确切的不同类型方剂在冠心病治疗起效过程中作用机制的差异[7]。

1 材料

1.1 动物模型

40 只清洁级日本大耳兔，雄性，体质量均为2.5-3.5 kg，购置于青岛康大生物科技有限公司。在辽宁中医药大学动物实验中心适应性喂养3-5天后进行正式实验。实验室温度20℃-26℃，湿度40%-70%，实验室证书编号：SYXK(辽）2019-0004。

1.2 试剂与仪器

仪器分析平台：LC-MS (Waters，Xevo G2-XS QTof)；乙腈（德国Merck 公司提供）、甲醇（德国Merck公司提供）、甲酸（中国上海CNW 公司提供）、超纯水（Mili-Q）、2-氯苯丙氨酸（中国上海GL Biochem 公司提供）

2 方法

2.1 样本采集及处理

40 只雄性白兔，随机分为空白组、模型组、通阳化浊方组与四妙勇安汤组4 组，每组10 只。空白组正常饮食，模型组给予高脂饲料喂养至第8 周，于第4 周结束后，用球囊法手术损伤实验兔的右侧颈总动脉；在模型组基础上，两个实验组分别在术后，灌胃给予通阳化浊方和四妙勇安汤，连续4 周，每日1 次。给药结束后，采取空白组与模型组病理和血液样本，证明造模成功的前提下，模型组与实验组每组抽取3只家兔，促凝管采集全血后，置冰上约30 min，12000 r·min-1离心10 min，取血清300μL分装EP管，置干冰中，用于血清代谢组学检测。

2.2 检测条件

2.2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，（100× 2.1 mm，1.8μm）；流速：0.3 mL·min-1；进样量：4μL；自动进样器温度：4℃；流动相组成A：水 + 0.1%甲酸；B：乙腈；流动相梯度洗脱程序（表1）。

2.2.2 质谱条件

扫描范围：50-1200；扫描时间：0.2 s；模式：ESI+和ESI-；毛细管电压：3 kV（ESI+）；2.5 kV（ESI-）；锥孔电压：30 V；碰撞能量（eV）：Low CE：6，HighCE：15-45；源温度：120℃；去溶剂化温度：550℃；锥孔气体流量：50 L·h-1；去溶剂化气体流量：900 L·h-1；数据采集时间：25 min。

表1 流动相洗脱程序

2.3 生物样品处理方法

血液样本置于室温解冻，用移液枪吸取100μL 样本于 1.5 mL EP 管中，加入 300μL 甲醇，涡旋混匀30 s。-40℃静置1 h，涡旋混匀30 s，4℃静置0.5 h。置于4 ℃离心机中，12000 r·min-1离心15 min。取出全部上清液于离心管中，-40℃静置1 h。置于4℃离心机中，12000 r·min-1离心15 min。吸取200μL 上清，并加入5μL 内标（140μg·mL-1，2-氯苯丙氨酸），转入进样小瓶中待LC-MS检测。

2.4 数据处理方法

本研究在使用SMICA-P 软件正式分析前，为获得更加直观可靠的结果，对数据组进行了归一化处理；采用PCA 的非监督性方法和OPLS-DA 的有监督性方法对样本进行建模分析，PCA 分析通过主要参数模型的解释率R2X来判别模型质量好坏，更真实地反映组间差异以及识别组内变异；OPLS-DA 分析以参数R2Y来描述模型的解释率，用Q2来表示模型的预测率，采用OPLS-DA 模型的 VIP 值，结合t检验的P值，寻找不同组别的差异性表达代谢物。

3 结果

3.1 总体PCA分析

采用PCA 模型鉴定各组之间代谢产物的差异，PCA模型由R2X和Q2值进行验证（图1）。

结果表明：由图1 分析可知，正模式下获得2 个主成分，累计R2X=0.502，Q2=0.182；负模式下获得2 个主成分，累计R2X= 0.436，Q2= 0.0772。在正模式下control 组、TYHZ 组和 SMYA 组样品间，在负模式下control组和SMYA 组间，虽然有部分重叠，但是均有分离趋势。QC 样本是等量混合了所有被检测样本，图中QC样本紧密聚集，证明方法稳定，重复性良好。

3.2 OPLS-DA分析

3.2.1 OPLS-DA得分图

图1 总PCA得分图

图2 control-TYHZ两组的OPLS-DA得分图

采用 OPLS-DA 模型鉴定 control-TYHZ 组、control-SMYA 组、TYHZ-SMYA 组之间代谢产物的差异（图2-4）。

结果表明：OPLS-DA 模型由 R2Y 和 Q2值进行验证，参数R2Y 代表模型与数据是否匹配，参数Q2用来提供对模型的预测能力的评估。R2Y、Q2都大于0.5 表示模型有很好的解释率和预测率，越接近1 模型的解释能力和预测能力越好。

由图2 分析可知，正模式下共得到1 个主成分和3个正交成分，R2X=0.863，R2Y=1，Q2=0.943；负模式下同样得到1 个主成分和3 个正交成分，R2X=0.893，R2X= 1，Q2= 0.934。在正模式和负模式下，control 组和TYHZ组间区分明显，所以内源性代谢物存在差异，说明TYHZ对于冠心病模型家兔有一定的作用。

由图3 分析可知，正模式下可以得到1 个主成分和3 个正交成分，R2X= 0.875，R2X= 1，Q2= 0.92；负模式下同样得到1 个主成分和3 个正交成分，R2X =0.855，R2X= 1，Q2= 0.732。在正模式和负模式下，control 组和SMYA 组间区分明显，所以内源性代谢物存在差异，说明SMYA 对于冠心病模型家兔有一定的作用。

由图4 分析可知，正模式下可以得到1 个主成分和3个正交成分，R2X=0.853，R2X=1，Q2=0.995；负模式下同样得到1 个主成分和3 个正交成分，R2X=0.851，R2X= 1，Q2= 0.865。在正模式和负模式下，SMYA 组和TYHZ 组间区分明显，所以内源性代谢物存在差异，说明TYHZ 和SMYA 对于冠心病模型家兔均有一定的作用。

图3 control-SMYA组的OPLS-DA得分图

图4 TYHZ-SMYA组的OPLS-DA得分图

3.2.2 OPLS-DA 3D-score图

图 5、图 6、图 7 分别为 control-TYHZ 组、control-SMYA 组和TYHZ-SMYA 组，其代谢物谱经OPLS-DA处理后得到的3D-score图。

3.2.3 OPLS-DA载荷图

结果表明：载荷图图中的每个点分别代表样本中检测到的一个代谢物信息，其距离中心原点越远，表明该代谢物对各样本组间的分离贡献度越大，就越有可能是潜在的生物标志物。

在图8 通阳化浊方与模型组的比较中，代谢物信息多聚集于离中心较远处，提示潜在生物标志物较多；图9 四妙勇安汤与模型组次之，图10 两个实验组间潜在的差异性生物标志物较少。

3.3 差异物质表

3.3.1 通阳化浊方与模型组比较

本研究中，为了探究通阳化浊方对冠心病（内皮损伤且高脂）模型的影响，将通阳化浊方与模型组比较，共筛选出45个差异化合物（表2）。

将上述鉴定出的差异化合物输入MetaboAnalyst（http://www. metaboanalyst.ca/）数据库，进行代谢通路分析（表3、图11）。

结果显示：control-TYHZ 组一共涉及18 条代谢通路，根据Impact值＞0.05 筛选出5 条主要代谢通路，即精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、牛磺酸和牛磺酸代谢、精氨酸生物合成和α-亚麻酸代谢。提示在血清中通阳化浊方对冠心病（内皮损伤合并高脂）模型的影响可能与这5 条代谢通路相关，影响这些代谢通路可能会对通阳化浊方在冠心病模型中作用产生影响。

图5 control-TYHZ两组的OPLS-DA 3D-score图

图6 control-SMYA两组的OPLS-DA 3D-score图

图7 TYHZ-SMYA两组的OPLS-DA 3D-score图

图8 control-TYHZ两组的OPLS-DA载荷图

图9 control-SMYA两组的OPLS-DA载荷图

图10 TYHZ-SMYA两组的OPLS-DA载荷图

3.3.2 四妙勇安汤与模型组比较

本研究中，为了探究四妙勇安汤对内皮损伤的高脂模型的影响，将四妙勇安汤与模型组比较，共筛选出27个差异化合物（表4）。

将上述鉴定出的差异化合物输入MetaboAnalyst（http://www.metaboanalyst.ca/）数据库，进行代谢通路分析（表5和图12）。

结果显示：control-SMYZ 组一共涉及11 条代谢通路，根据Impact值＞0.05 筛选出2 条主要代谢通路，即牛磺酸和牛磺酸代谢和组氨酸代谢。提示在血清中四妙勇安汤对内皮损伤的高脂模型的影响可能与这2条代谢通路相关，影响这些代谢通路可能会对四妙勇安汤对内皮损伤的高脂模型产生影响。

表2 control-TYHZ组血清样本差异物质列表

表3 control-TYHZ组血清样本代谢途径列表

图11 control-TYHZ血清组代谢途径分析结果

4 讨论

在理论基础方面：胸痹之为病，大体脾虚运化水湿不利，久则聚湿成痰，痰浊壅遏中焦，蒙蔽胸阳，阳气不得疏布而致。本研究针对冠心病较为公认的“湿浊”与“热毒”两个病理因素，通过“化湿”与“清热解毒”两类中药干预的对比，探讨其在治疗冠心病过程中起效的不同作用途径，为研究中冠心病“早期湿化、中期热化、晚期虚化”的理论假说提供数据支持。

表4 control-SMYZ组血清样本差异物质列表

在用药选择方面：通阳化浊方为路志正国医大师的临床验方。路志正国医大师致力于推广脾胃学说，提出“持中央、运四旁”的学术观点，为冠心病治疗提供了中医诊疗思路[8-10]。方中广藿香辛而微温，专入脾胃，以其芳香化浊，和中祛湿，宣散湿浊中阻，消解胸闷脘痞，为君药。厚朴、枳实味辛苦，亦归脾胃，两药相须为用，辛开苦降，善燥湿化痰，宽胸散结，行气消痞，以助君药祛痰化浊，振奋中焦，疏布胸阳之力，合为臣药。另取苦杏仁降气祛痰而宽胸；茵陈清利而导湿下行；郁金行气活血而止痛，合而祛痰湿，行瘀滞，宽胸膈，蠲痹痛，共为佐药。本剂寒温合用，性偏温和。袪痰化浊，振奋脾胃，消除阴霾而治其本；化瘀行滞，宽胸散结，通阳蠲痹而理其标。六味合用，共奏祛痰化浊，宽胸散结，通阳蠲痹之效。四妙勇安汤以治疗热毒炽盛证见长，临床应用较为广泛，基于抗炎、抗氧化、调血脂、抗血栓、改善血液流变等临床药理作用，其在冠心病治疗中的应用研究引起关注[11-15]。方中金银花清热解毒，重为君药；玄参清热凉血，泻火解毒，当归活血化瘀，与玄参合用养血滋阴而生新，共为臣药；生甘草清热解毒，调和诸药，自为佐使。

表5 control-SMYZ组血清样本代谢途径列表

图12 control-SMYZ血清组代谢途径分析结果

在方法选择方面：代谢组学技术由Nicholson 在1999 年首次提出，它是继基因组学和蛋白质组学之后，系统生物学的重要组成部分。由于代谢组学可以使用尿液或血液做无损的连续取样，通过大规模信息提取技术，观察疾病发生、发展过程中内源性代谢产物的动态变化，揭示人体内部各组成成分相互作用和运行规律，在中药复方药理学研究方面，与中医“整体观”“动态观”“辨证观”相吻合，对探讨疾病早期诊断与初步疗效的生物标志物，具有明显优势[16，17]。

在代谢途径方面：牛磺酸和牛磺酸代谢、组氨酸代谢是通阳化浊方与四妙勇安汤共同涉及的两条主要代谢通路，除此之外，通阳化浊方的代谢还与精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成以及α-亚麻酸代谢通路相关。既往研究表明，牛磺酸作为游离氨基酸中的一员，具有较强的抗氧化活性，能够通过清除自由基，改善冠心病患者血管内皮的舒张功能，从而减少心肌受损，在冠心病，特别是痰瘀或瘀热互结证患者中，血液含量明显低于正常人[18，19]；脱羧酶催化组氨酸生成组胺，大量组胺可诱导冠脉收缩，还可扰乱心肌内皮和线粒体功能，其释放水平与冠心病严重程度呈正相关，用药后组氨酸水平的降低，提示CHD 的心肌缺血程度减轻[20-22]；精氨酸在冠心病中的作用，主要通过二甲基精氨酸二甲胺水解酶-非对称性二甲基精氨酸（DDAH-ADMA）系统，来抑制NOS 生物利用度，精氨酸和ADMA 的降低，可以一定程度上维持及稳定血管内皮功能，减少冠心病的发生[23-25]；脯氨酸参与蛋白质氨基酸的代谢过程，可作为判断是否冠心病血瘀证的主要物质，能够区分气虚血瘀与其他血瘀证，与冠心病血瘀证发生成负相关[26-28]；α-亚麻酸属于多不饱和脂肪酸（ω3-PUFAs），是人体必需脂肪酸，它可通过减弱对血管平滑肌刺激或影响前列腺素生成而起到降压作用，有研究报道，不饱和脂肪酸可降低冠心病发病风险，保护性脂肪酸含量降低与CHD 密切相关[29，30]。