基于网络药理学及分子对接技术探讨追风透骨胶囊对类风湿关节炎和骨关节炎“异病同治”的潜在分子机制＊

沈 浮，沈乐乐，卢 敏，卢芳国，邝高艳＊＊，吴泳蓉，赵昱东，夏 雨，邓 博＊＊

（1. 湖南中医药大学研究生院 长沙 410208；2. 宁夏医科大学研究生院 银川 750004；3. 湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410007；4. 湖南中医药大学医学院 长沙 410208；5. 成都中医药大学研究生院 成都 610075）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）和类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）分别为退行性关节炎及炎性关节炎的代表性疾病，是目前导致关节功能障碍和致残的重要原因，其慢性持续的关节疼痛状态严重影响人们生活质量[1，2]。OA 的基本病理特征主要包括软骨细胞的退变和细胞外基质降解，常累及膝、髋等负重关节，RA 是一种以慢性滑膜炎及血管翳形成为主要病理改变的慢性自身免疫性疾病[3，4]。尽管两者的发病机制有所不同，但均有 IL-1b、IL-6、TNF-α 等炎症介质的参与[5]。目前尚无特效药物，西医治疗以缓解疼痛症状、延缓病情进展为主。二者均属于中医“痹症”的范畴，且病因病机也多有相似，素体虚弱，正气不足，卫外不固，腠理不密，是诱发本病的重要因素[6，7]，中医辩证施治对于痹症的治疗具有独特的优势，且疗效显著、不良反应少，适宜长期服用，近年来愈发受到重视[8]。

表1 数据库及软件工具

追风透骨胶囊最早出处可追溯到明朝董宿《奇效良方》中的大追风散，“百节酸疼……项背拘急……面上游风，状若虫行，一切头风”记载的大追风散初衷本用于祛风化痰而利头，而痹症同为风邪所害，并多兼有气滞血瘀，后人配伍祛湿散寒、行气活血之品，并经剂型优化改革，遂成追风透骨胶囊[6,9]。临床上使用追风透骨胶囊治疗OA、RA 疗效显著，在多项临床研究中显示，追风透骨胶囊可有效改善RA 患者的关节疼痛、肿胀及晨僵等临床症状，并显著降低RA 患者红细胞沉降率、C反应蛋白以及类风湿因子等炎性指标[6,10]，追风透骨胶囊亦可降低OA 患者的骨关节指数评分（VOMAC）、视觉模拟量表（VAS）评分而显著改善患者关节活动度及疼痛反应，降低血清炎性介质水平，下调血液粘稠度，提高患者生活质量[6,11-13]，对于痹症的临床治疗有良好的应用价值。异病同治为中医独有的诊疗思维，最早出自《黄帝内经》，指在中医理论指导下，不同疾病在其病情进展过程中出现相似的证候，从而采取同样的的治疗方法，可获同样理想的疗效，反映了中医辨证论治的特点[14，15]。追风透骨胶囊对于寒湿痹阻型的OA、RA 均具有良好的疗效，体现了异病同治的理念[16]。

然而，由于中药复方中成分多且复杂，疾病和中医证候涉及到许多分子变化，因此大多数中药方剂在复杂疾病中的组合规律和作用仍有待阐明[17]。随着现代生物信息学的发展，海量信息获取技术的成熟，尤其是计算能力及系统建模的发展，为中药方剂在“生物网络”的应用赋予了实质性的内涵[18]，高通量信息技术为中药复方干预疾病靶标的机制研究提供快捷的方法和新的机遇，并与中药复方复杂成分及多途径、靶点干预疾病的机理向贴合[19，20]。近年来，不少学者陆续开展了追风透骨胶囊治疗OA、RA 的临床对照试验研究，但其内在机制尚缺乏完整的现代医学证据。本研究利用高通量信息技术及分子对接法探讨追风透骨胶囊对于OA、RA 异病同治的潜在分子机制进行预测，以期进一步拓展追风透骨胶囊异病同治的科学内涵，为该药的深入研究和临床应用提供更多可靠的理论依据。

1 资料及方法

1.1 数据库及软件工具

如表1所示。

1.2 追风透骨胶囊化学成分筛选及其靶标的获取

本研究依托TCMSP、BATMAN-TCM 数据库检索追风透骨胶囊的21 位味中药（地龙、朱砂未收集在内）：制 川 乌（chuanwu）、香 附（xiangfu）、川 芎（chuanxiong）、麻黄（mahuang）、制草乌（caowu）、当归（danggui）、赤小豆（chixiaodou）、羌活（qianghuo）、赤芍（chishao）、细辛（xixin）、制天南星（tiannanxing）、白芷（baizhi）、甘草（gancao）、白术（baizhu）、没药（moyao）、乳香（ruxiang）、茯苓（fuling）、桂枝（guizhi）、天麻（tianma）、甘松（gansong）、防风（fangfeng）的所有化学成分。在TCMSP数据库的筛选标准为，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%并且类药性指数（drug-likeness，DL）≥ 0.18[21]，在 BATMAN-TCM 数据库的筛选条件为：靶点蛋白为高可信度（prediction score cutoff ＞ 20）[22]，并将上述候选化合物的潜在靶点上传至UniProt数据库，进一步获得对应的基因信息。

图1 追风透骨胶囊药物有效活性成分分布情况

1.3 追风透骨胶囊治疗OA、RA 的“药物-化合物-共有靶标”网络图构建

OA、RA 相 关 疾 病 靶 点 来 源 于 GeneCards、DisGeNET 数据库，将化合物作用靶点与疾病靶点取交集，获取追风透骨胶囊干预两者的的共有靶标，并导入Cytoscape 3.7.0 构建“药物-化合物-共有靶标”网络图以备后续分析。

1.4 追风透骨胶囊干预OA与RA的互作靶蛋白提取

利用STRING 数据库进行共有靶点的蛋白质间相互作用关系（protein-protein interaction，PPI）分析，设置combined score ＞0.9，并将结果利用Cytoscape 3.7.0绘制PPI网络图，并进行拓扑分析，以度值大于中位数的2倍筛选出关键共有靶点。

1.5 GO及KEGG通路相关富集分析

为深入探究对追风透骨胶囊异病同治相关生物途径及机制，本研究运用R语言调用Bioconductor数据包进行追风透骨胶囊干预OA、RA 靶基因的基因本体功能富集（gene ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics，KEGG）通路富集分析，设定P＜0.05具有统计学意义，并对分析结果进行可视化。

1.6 追风透骨胶囊中核心化合物与OA 和RA 共同作用靶蛋白的分子对接验证

为进一步验证追风透骨胶囊中核心化合物与OA和RA 共同作用靶蛋白的结合情况，利用SYBYL-X 2.1.1 软件中Surflex-dock 模块进行分子对接，以追风透骨胶囊中核心化合物为配体，OA 和RA 共同作用靶蛋白为受体，该对接工具匹配方法主要基于结构及形状的相似性，有高准确性、高阳性率及匹配速度迅速的特征[23]。一般认为，受体与配体的自由结合能越小，其稳定性越强，则Total score 值越大。Total score ≥5.0意味着配体与靶蛋白之结合活性较优，而Total score ≥7.0 则可预测该配体分子与靶蛋白结合活性较为强烈[24]。

2 结果

2.1 追风透骨胶囊活性化合物筛选结果及分布特征

通过检索TCMSP、BATMAN-TCM 数据库最终筛选收集到追风透骨胶囊中21 味药物（地龙、朱砂未收集在内）所含的活性化学成分共276 种，其中川乌1个、香附 14 个、川芎 6 个、麻黄 21 个、草乌 4 个、当归 2个、赤小豆 1 个、羌活 9 个、赤芍 11 个、细辛 6 个、天南星6个、白芷16个、甘草74个、白术4个、没药22个、乳香 2 个、茯苓 3 个、桂枝 6 个、天麻 5 个、甘松 4 个、防风17 个，活性化合物在各类中药的分布比例如图1A 所示，共获取有效活性化合物靶标共475 个。由于各类中药含有相同类型的活性成分，本研究组对各组分的中药所含成分进归纳（图1B），β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、茚酚、山柰酚在追风透骨胶囊中各组分中药的分布范围最广。

图2 追风透骨胶囊与疾病靶点韦恩图

2.2 OA及RA疾病靶基因收集结果

通过 GeneCards、DisGeNET 数据库搜集 OA、RA 相关疾病靶点，去重后获得RA 疾病靶点共4856 个，OA疾病靶点共3145 个，将以上2 组疾病靶点与追风透骨胶囊475 个作用靶点进行交集，共获得交集靶标207个（图2）。

2.3 “药物-化合物-共有靶标”网络图构建结果

通过Cytoscape 3.7.0 软件构建“药物-化合物-共有靶标”网络图（图3），图中共有节点410 个，边1185条，该网络的平均度值为5.78，大于其平均值2 倍的有效活性成分有12 个，分别是槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、间羟基苯甲酸（m-hydroxybenzoic acid）、黄芩苷（baicalein）、异鼠李素（isorhamnetin）、刺 槐 素（acacetin）、汉 黄 芩 素（wogonin）、β- 谷 甾 醇（beta-sitosterol）、杨 梅 酮（myricanone）、隐丹参酮（cryptotanshinone）、8-异戊烯-山奈酚（8-Isopentenyl-kaempferol），提示其为该网络的关键性有效活性成分，在追风透骨胶囊干预OA 以及RA 的过程中其重要作用。从网络图可以看出，部分活性成分具有相同的作用靶点，说明各组分的药效具有协同作用。HSP90AA1、ESR1、CALM1、NOS2、AR为追风透骨胶囊干预OA、RA的关键靶基因。

2.4 追风透骨胶囊干预OA 与RA 的互作靶蛋白提取结果

通过STRING 数据库，进行PPI，并通过Cytoscape软件进行可视化分析（图4A），共有节点数173 个，边数863 条，度值中位数为12，根据度值大于中位数2 倍筛选出核心网络蛋白12 个（图4B），分别为STAT3、AKT1、APP、JUN、MAPK1、TNF、HSP90AA1、RELA、IL6、MAPK14、VEGFA、MAPK8。这12 个靶蛋白为PPI网络中的核心节点，很可能是追风透骨胶囊干预OA以及RA的关键靶蛋白。

图3 追风透骨胶囊干预OA、RA的“药物-化合物-共有靶标”网络图

2.5 GO与KEGG富集分析

根据P值的大小，本研究用条形图列举了各类排名靠前的GO 富集分析结果（图5），其中生物过程（biological process，BP）2606个，主要涉及脂多糖反应、细菌来源分子反应、氧化应激反应、细胞氧化应激反应、金属离子反应等（图5A）；细胞组成（cellular component，CC）85 个，主要涉及膜筏、膜微域、膜区、囊泡腔、细胞质囊泡腔等多种细胞结构（图5B）；分子功能（molecular function，MF）170 个，主要涉及细胞核受体活性、转录因子活性，直接配体调控特异性DNA 结合等（图5C）。

在KEGG 富集结果筛选得到153 条主要信号通路，根据通路上富集的基因数目对排序前20的通路及对应的基因导入Cytoscape中绘制“靶基因-信号通路”网络并进行可视化（图6）。该网络图主要涉及代谢相关通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis）、病毒 感 染 相 关 通 路（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Hepatitis C、Human cytomegalovirus infection）、炎性反应相关通路（IL-17 signaling pathway）、肿瘤相关通路（TNF signaling pathway、Prostate cancer）等多种信号途径。

图4 追风透骨胶囊作用OA、RA共同靶标的PPI网络及核心靶蛋白

2.6 追风透骨胶囊中核心化合物与OA 和RA 共同作用靶蛋白的分子对接验证

为进一步验证追风透骨胶囊干预OA 以及RA 的分子机制，从PubChem 数据库中提取追风透骨胶囊中的关键有效活性成分作为配体，从Protein Data Bank数据库提取PPI中的核心靶蛋白作为受体进行分子对接，对接Total score 结果如图7 所示，在144 个对接结果中，59个提示有较优的（Total score ≥5.0）对接活性，9 个有强烈的匹配活性（Total score ≥ 7.0），其中β-谷甾醇与核心靶蛋白结合情况最佳，HSP90AA1 是追风透骨胶囊中关键化学成分结合活性最优的靶蛋白。

Total score 值最高的4 组对接情况在如图8 所示，8-异戊烯-山奈酚通过氨基酸残基TYR139、LEU103、ASN51 形成3 条氢键（图8A）；β-谷甾醇通过氨基酸残基 LYS58 形成 1 条氢键（图 8C）；两者均能与HSP90AA1密切结合。β-谷甾醇与APP通过氨基酸残基ASN84 形成1 条氢键（图8B）；异鼠李素通过氨基酸残 基 ARG69、GLN37、LYS55、GLU109、LEU110、MET111、SER34 形成 7 条氢键与 MAPK-8 受体靶蛋白紧密结合（图8D）。并且上述配体化合物均能良好的包埋在直径为5A的受体靶蛋白的活性口袋中。

3 讨论

图5 追风透骨胶囊治疗OA、RA共同潜在靶点的GO富集分析

图6 追风透骨胶囊干预OA、RA共同潜在靶点的“靶基因-信号通路”网络

图7 追风透骨胶囊中的关键活性化合物与PPI核心靶蛋白分子对接Total score值热图

图8 追风透骨胶囊中关键活性化合物与PPI核心靶蛋白分子对接对接情况

OA 与RA 均属于中医“痹症”范畴，其病机多为本虚标实，外感风、寒、湿之邪易诱发本病，追风透骨胶囊由制川乌、香附、川芎、麻黄等23 位药物组成，其中细辛、川乌散寒温经通络，羌活、防风祛风除湿，并配伍赤芍、当归等养血活血之品，共效活血通络、散寒祛湿之功。现代研究证明，追风透骨胶囊具有显镇痛抗炎及抗凝的功效，能加速血液循环、改善血液粘稠度，调节机体免疫平衡[25]，其改善关节炎症反应可能与下调滑液及滑膜组织中miR-155、TGF-β1 的表达有关[26]。川乌在追风透骨胶囊为君药，其不仅能显著抑制前列腺素E、组胺等炎性介质的释放，在体外还可抑制软骨细胞基质降解，降低单碘乙酸盐诱导的软骨细胞损伤，对OA 模型具有一定的软骨保护作用[27，28]。川芎与当归的配伍增强了追风透骨胶囊的抗炎镇痛效应，有研究显示两者配伍比例为1:1 时，其活血化瘀之功最优，这与追风透骨胶囊中二者的配比相吻合[29]。芍药苷为追风透骨胶囊臣药赤芍的主要成分，有报道显示，芍药苷能显著改善RA 模型大鼠的足肿胀，降低关节内的 TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎因子的释放，抑制Rho 激酶在滑膜组织内的激活，以及下调p-NF-κB、p65和p-MYPT1的表达[30]。

本研究利用网络药理学及分子对接的方法对追风透骨胶囊对于OA、RA 异病同治的机制进行探讨，在“药物-化合物-共有靶标”网络图中对追风透骨胶囊干预OA 及RA 共有靶标的关键有效活性成分进行了筛选，并通过分子对接技术对筛选得到的活性成分及进行验证，其中槲皮素、木犀草素、山奈酚的度值排名靠前，而在分子对接结果中β-谷甾醇与核心靶蛋白结合情况最佳，提示它们在追风透骨胶囊干预OA、RA发挥的作用最大。追风透骨胶囊中关键活性成分多归类于黄酮类单体化合物，现代研究表明槲皮素可减少 TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎性细胞因子生成，调控NF-κB、Nrf-2/HO-1 等多种炎症相关信号通路，降解弱炎症环境下软骨细胞内MMP-13 产生、基质降解和细胞凋亡，从而保护关节软骨，具有治疗OA 以及RA的潜在药物价值[31-34]。木犀草素是一种具有多种药理特性的天然黄酮，由于其具有较强的抗炎作用，木犀草素已被用于治疗多种炎性相关疾病，有报道显示，木犀草素可通过下调的OA 软骨细胞JNK、p38 的表达以及抑制NF-κB磷酸化，来抑制NO、TNF-α和IL-6的释放，并逆转II 型胶原蛋白的降解，从而减缓软骨的退化[35，36]。山奈酚通过抑制bFGF-FGFR3–RSK2信号传导抑制RA-FLSs 的增殖和迁移，从而减少IL-17、IL-21 和TNF-α等活化的T 细胞介导的炎性细胞因子的释放，进而降低体外和体内的破骨细胞分化，对于RA 的诱导和进展发挥关键作用[37，38]。β-谷甾醇具有抗炎效应及免疫调节的功效，其可提高脂多糖（LPS）诱导的J774A1 巨噬细胞的IL-10 活性，减小趋化因子和促炎因子活性，亦可以增加Th-1 型淋巴细胞增殖，调节体内免疫从而抑制IL-6 和TNF 发挥抗炎作用[39]。本研究预测得出在追风透骨胶囊干预OA、RA 的过程主要涉及 HSP90AA1、ESR1、CALM1、NOS2、AR 等靶基因，其中Ⅱ型一氧化氮合酶（NOS2）相关基因与关节内滑膜炎症密切，普遍认为高浓度的NO 抑制与线粒体代谢有关的多种酶，此外，在病理条件下，迅速分解为具有很强毒性的NO2 相关自由基从而对滑膜、软骨细胞有直接杀伤作用[40]。CALM1 基因位于编码Ca M染色体上，有研究显示Ca M 与细胞内Ca2+结合的情况较为多见，并参与关节软骨中软骨细胞的分化及维持软骨正常形态和功能[41]。本研究通过网络药理学对于追风透骨胶囊干预OA、RA 的关键活性化合物及潜在靶基因进行预测，部分结果干预OA、RA 的机制已在体内外实验中得到体现，表明通过此法筛选的化学成分虽有一定的参考价值，另外，仍有部分预测结果在目前发表的文献中尚未得到验证，其可能是追风透骨胶囊对于OA、RA 异病同治的潜在活性成分，还需要结合进一步实验研究。

根据PPI 核心蛋白的网络分析中的度值排序，靠前的核心靶标主要与炎症、免疫、增殖以及分化相关联，分子对接结果提示追风透骨胶囊中关键活性成分与HSP90AA1 靶蛋白结合活性最优。HSP90AA1 诱导NF-κB 信号通路组分的抑制后降解，阻滞该信号通路的激活，并导致炎性细胞的细胞因子产生减少，并且越来越多的证据表明，HSP90AA1 相关的靶向药物减少滑膜炎症和防止软骨破坏，有助于RA 的治疗[42]。STAT3 是信号转导与转录激活因子（STAT）家族成员之一，其激活可导致促炎细胞因子的产生和免疫反应增加，通过抑制STAT3 的表达可以限制免疫炎症反应，改善自身免疫性相关的关节炎症状[43，44]。AKTI 通过Thr308 和Ser473 的磷酸化激活，活化的AKT1 通过多种信号途径促进细胞生长，并使凋亡级联的各种成分失活来参与OA 的进展[45]。IL-6 是重要的促炎因子，在RA、OA 患者的血清以及关节滑液中均明显升高[46]，其可增强 RA 发病过程中 IL-1 和 TNF-α的效应可加速B 淋巴细胞增殖，活化T淋巴细胞，破坏关节软骨，并通过IL-6 通过JAK/STAT 信号通路的介导影响滑膜细胞纤维化以及骨的再吸收加速病情进展[47-48]。TNF-α亦扮演了重要的角色，可诱导效应T 细胞引起滑膜组织损伤[49，50]。MAPK8、MAPK14 均属于丝裂原活化蛋白激酶家族，它们参与调节许多细胞功能，如分化、增殖、凋亡和炎症反应，其参与RA 的疾病进程中得到广泛验证[51]。血管生成活动对于OA 与RA 的诱发及进展有着密切的联系，血管内皮生长因子（VEGF）与内皮细胞（EC）上的同源受体结合，并激活这些细胞产生蛋白水解酶，其降解基底膜导致内皮细胞迁移并进一步增殖，这是RA 滑膜血管生成的重要促炎过程[52]。由此推测追风透骨胶囊对于OA、RA 的干预涉及多种靶蛋白，这些可能追风透骨胶囊对于两者异病同治的潜在治疗靶点，本研究预测的相关靶标基于高通量信息技术进行科学筛选，可为后续相关靶点的深入研究提供有意义的参考。

为了深入了解追风透骨胶囊对于OA 和RA 异病同治的作用机制，本课题组基于R 语言调用相关程序包对追风透骨胶囊干预OA、RA 的交集靶标进行GO及KEGG富集分析，GO富集分析提示追风透骨胶囊异病同治的生物学途径主要涉及脂多糖生物反应、细菌分子应激反应以及氧化应激等生物学过程，以及核受体、细胞因子活性等多种分子功能。KEGG 分析结果发现炎性反应、代谢、病毒感染、肿瘤相关通路富集较多的靶向基因，其中AGE-RAGE 排名最靠前，对于晚期糖基化终产物（AGEs）信号传导途径的深入研究，使人们认识到AGEs 可以诱导人OA 滑膜细胞COX-2 的表达和前列腺素 E2（PGE2）、IL-6 和 MMP-13 的产生[53]，另外AGEs 受体中和抗体（RAGE）能有效逆转人滑膜细胞的炎症反应和VEGF 生成，提示RAGE 在滑膜细胞活化中起重要作用，从而促进OA 的进展[54]。IL-17通路在RA进程中被MMP13被激活，miR-19a可以通过介导IL-17 信号通路介导HFLS-RA 的增殖和侵袭，从而调节RA 人成纤维样滑膜细胞中MMP13 的表达，从而参与软骨细胞的降解[55]。可以发现，追风透骨胶囊作用对于OA、RA 异病同治作用途径的范围十分宽泛，并可以通过多种途径对不同的信号通路及生物学过程进行干预，由于通路的筛选基于相关靶基因在备选通路的富集数目进行筛选，不排除部分通路的预测出现假阳性的结果，因此，后续科研验证工作仍需结合OA、RA 相关前期文献研究进行综合分析，本课题组认为追风透骨胶囊发挥异病同治的机制非常复杂，本次预测筛选的炎症、代谢及肿瘤相关的通路具有后续研究的参考意义。

本研究仍存在一些不足之处，首先，由于数据库的局限性，追风透骨胶囊中地龙、朱砂尚未纳入本次研究范围内，且本研究依赖于TCMSP、BATMAN-TCM等数据库对于追风透骨胶囊各活性成分的收集，由于数据库本身可能存在对于药物活性成分及对应靶标的欠完整性及准确性不高等局限，对于各组分中药在体内的相互作用及代谢情况尚不明确，这与追风透骨胶囊实际干预OA、RA 的机制可能存在偏倚，后期研究可以通过液相色谱等方法来获取活性成分来提高准确性。其次，根据中医辩证论治的基本原则，追风透骨胶囊干预寒湿痹阻证的痹症更符合中医的病理病机，由于目前暂缺乏中医证候相关的基因数据库，因此本研究尚无法做到方证对应，后续研究可以通过基因芯片方法得到该证候相关的差异基因并加以实验验证。综上所述，通过网络药理学方法及分子对接技术对追风透骨胶囊干预OA、RA 异病同治作用的机制进行预测，筛选得到的关键活性化合物、核心靶标以及相关通路与目前研究OA、RA 的机制具有一致性，并且在分子对接验证结果中多数活性成分与靶蛋白结合匹配度较高，从一定程度上表明预测结果的可靠性与准确性，体现了追风透骨胶囊具有多成分、多靶点、多途径的特点，并丰富了追风透骨胶囊异病同治的科学内涵，可为下阶段的研究提供参考。