基于网络药理学探析疏风解毒胶囊治疗新型冠状病毒肺炎分子机制研究＊

张婉晴，单 思，黄诗琦，吴欣宇，刘鑫炀，刘红宁，严小军

（江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心/江西省中医病因生物学重点实验室 南昌 330004）

2019 年12 月新型冠状病毒肺炎（corona virus disease，COVID-19）在中国迅速传播，给我国人民的健康和经济造成巨大损失。随后国家卫生健康委员会发布公告表示，将COVID-19纳入《中华人民共和国传染病防治法》中的乙类传染病，采用甲类传染病的相关措施进行防控[1]。在治疗方面，要求加强中西医相互结合诊治，大力发展中医药，以促进COVID-19的救治取得良好成效。

COVID-19 属于中医“疫病”范畴，病位在肺脾，基本病机特点为湿、毒、瘀、闭[2]。中医药学具有治疗疫病的数千年的经验，有其独特优势，且大部分COVID-19 患者为轻型，因此早期的中医药有效干预对于提高治愈率、降低病死率有着至关重要的作用[3]。

基于传统中医药积累的实践经验对中医药防治疫病的认识，吴丽丽等对中医药防治COVID-19 进行循证医学分析，中药能够直接作用于病毒，有效阻断病毒生长繁殖过程中的某一环节，从而达到杀灭病毒或抑制病毒复制的作用，并且能够通过促进机体免疫功能达到抑制病毒的目的，在面对突发性的传染疾病时发挥着不可替代的重要作用[4]。

疏风解毒胶囊被证实有疏风清热，解毒利咽的显著功效，是国家卫生健康委员会发布的第7版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行）》中针对COVID-19 早期推荐使用的中成方之一[5]，亦是我国科研团队在武汉前线临床治疗和观察中总结出来的有效方剂。主要由虎杖、连翘、板蓝根、柴胡、败酱草、马鞭草、芦根及甘草8味药材构成。其中虎杖为君药，具有祛风除湿，攻诸肿毒之效。连翘和板蓝根共为臣药，以助君药清热解毒，散结消肿，清热逐风。柴胡和表解里；败酱草清热解毒，善消痈肿、结热；马鞭草清热解毒，活血散瘀；芦根清降肺胃，生津止渴，4 药共为佐药。甘草甘平为使药，养胃气以助行药，且具调和诸药之效。此配伍方具有祛风清热，解毒，抗病毒的作用[6，7]。邢佳振等研究发现疏风解毒胶囊联合特布他林治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期的整体疗效确切，能够迅速稳定气道炎症与系统性炎症并抑制免疫过激反应。鲍岩岩等研究通过体外抗病毒实验及对副流感病毒引起的小鼠病毒性肺炎治疗作用，发现疏风解毒胶囊对多种流感病毒均有抑制作用，结果提示疏风解毒胶囊具有体外广谱抗病毒作用且对副流感病毒致小鼠肺炎有良好的治疗作用[8，9]。

本研究基于疏风解毒胶囊具有多成分、多靶点协同作用的特点，旨在通过生物信息学方法结合生物通路分析（Ingenuity Pathway Analysis，IPA）软件全面预测分析COVID-19和疏风解毒胶囊二者之间的分子作用网络和作用位点，以期为深入探析疏风解毒胶囊治疗COVID-19的分子机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 获取COVID-19靶点数据

运用 GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/），查找COVID-19相关基因，通过在人类基因数据库 中 输 入“New Coronary Pneumonia”，检 索 得 到COVID-19 相关人类基因，以Excel 格式导出，按照得分≥8进行筛选基因，获取Gene Symbol。

1.2 获取和筛选疏风解毒胶囊的活性成分数据

利用中药系统药理学分析平台数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw. com/tcmsp.php），查找疏风解毒胶囊中虎杖、连翘、板蓝根、柴胡、败酱草、马鞭草、芦根、甘草8 味中药的活性成分。由于疏风解毒胶囊为口服中成药，故采用吸收、分布、代谢、排泄（absorption、distribution、metabolism、elimination，ADME）模型筛选有效活性成分及靶标。参考数据库推荐筛选条件制定筛选标准：相对分子质量（molecular weight，MW）180-500，生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物类药性（drug-likeness，DL）≥ 0.18，半衰期（half life，HL）≥ 4 h，且PubChem_Cid的成分＞ 0[10]。

1.3 预测疏风解毒胶囊的药物靶蛋白

检索有机小分子生物活性PubChem（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中疏风解毒胶囊各活性成分的相关分子信息，输入PubChem_Cid 查找并获取靶蛋白Canonical SMILES。将相应的Canonical SMILES 粘贴，通过 Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库预测化合物可能的作用靶点，按Pro ＞0.7 筛选并获取相应靶蛋白Common Name。

1.4 获取疏风解毒胶囊靶蛋白和COVID-19共同靶标

将筛选后的疏风解毒胶囊活性成分靶蛋白与COVID-19 相关基因靶点绘制韦恩图，提取交集靶标基因，即为潜在的生物靶点。

1.5 构建疏风解毒胶囊和COVID-19分子网络

基于生物通路分析（Ingenuity Pathway Analysis，IPA）软件的Dataset Files 功能，分别将疏风解毒胶囊对应靶蛋白Common Name 及COVID-19 的人类基因Gene Symbol，数据导入IPA。运用模块核心分析功能进行分析，构建疏风解毒胶囊靶蛋白及COVID-19 相关基因分子网络图。

1.6 比较疏风解毒胶囊靶蛋白及COVID-19 人类基因相同的生物学通路和作用位点

运用生物通路分析软件IPA 中比较分析模板功能，分析疏风解毒胶囊靶蛋白及COVID-19 相关基因共同作用的生物学通路；选取部分相同的通路进行深入的分析，筛选出二者在生物学通路中共同作用的位点。基于生物通路和位点筛选的结果，可以预测疏风解毒胶囊作用于COVID-19的相关分子网络机制。

2 结果

2.1 COVID-19相关基因数据

截止至 2020 年 4 月 16 日，在 GeneCards 数据库中查找COVID-19 相关人类基因，按照得分≥8 条件筛选出546个COVID-19相关基因。相关得分排序前15个基因（表1）。

2.2 疏风解毒胶囊的活性成分筛选

截止 2020 年 4 月 17 日，利用 TCMSP 数据库检索疏风解毒胶囊中8 味中药的相关信息，以MW 介于180 - 500 之间、OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18、HL ≥ 4 h，且PubChem_Cid 的成分＞0 为条件，筛选出的化学成分各有6、8、19、10、9、9、1、60 个，筛除21 个重复值最终获得疏风解毒胶囊有效活性成分共101个（表2）。

表2 疏风解毒胶囊的关键有效活性成分

表1 COVID-19相关主要基因数据

续表

续表

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2.3 靶蛋白数据的获取筛选及COVID-19 疾病靶标提取结果

利用 PubChem 数 据库和 Swiss Target Prediction 数据库，获取疏风解毒胶囊有效活性成分人类靶蛋白（3个成分预测无结果），以Excel格式上传IPA数据库，数据库比对后，匹配疏风解毒胶囊靶蛋白共计102 个（Pro ＞0.7）。通过检索GeneCards 数据库获取共546个COVID-19 疾病相关基因，与疏风解毒胶囊活性成分预测靶蛋白相映射，可得到交集靶点27个（图1），即为疏风解毒胶囊作用于COVID-19的潜在靶点。

2.4 构建疏风解毒胶囊和COVID-19分子网络

分别将疏风解毒胶囊有效活性成分靶点及COVID-19 相关基因导入IPA 进行“核心分析”功能分析。结果表明，构建的疏风解毒胶囊与COVID-19 分子网络庞大且多样化，相关的生物学功能丰富，但仍具有交集，两者网络共同交联分子和相同的功能（表3）。COVID-19 基因与疏风解毒胶囊靶蛋白最高分网络共同交联因子为APP、F2、NOS2（图2）。

2.5 疏风解毒胶囊与COVID-19的生物学通路比较

运用IPA 软件的比较分析模块，分析疏风解毒胶囊成分靶点和COVID-19 相关基因作用的生物学通路，结果发现二者共同作用通路有331 条，以炎症、免疫以及细胞增殖、凋亡和迁移相关通路为主（图3），提示疏风解毒胶囊活性成分可能通过干预炎症、免疫以及细胞增殖、凋亡和迁移的相关通路治疗COVID-19。

2.6 疏风解毒胶囊与COVID-19 生物学通路作用位点分析

疏风解毒胶囊有效活性成分靶蛋白和COVID-19相关基因共同交联靶分子有ABCB1（三磷酸腺苷黏合转运体 B1）、AKT1（AKT 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1）、ALOX5（花生四烯酸5-脂氧合酶）、APP（淀粉样β前体蛋白）、AR（雄激素受体）、CXCR1（趋化因子受体1）、ESR1（雌激素受体1）及F2（凝血因子II）等27 个。基于以上分析结果选取了一条IL-8信号通路，在通路中边框涂色标记的趋化因子受体1（chemokine receptor 1，CXCR1）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR、ErbB-1 或 HER1）、基质金属蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）及基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）等多个位点为疏风解毒胶囊有效活性成分靶蛋白参与COVID-19相关通路的作用位点（图4）。

图1 疏风解毒胶囊与COVID-19靶点韦恩图

3 讨论

由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）诱发的COVID-19具有高传染率和高死亡率。从COVID-19疫情暴发至今，针对COVID-19 早期的治疗干预，《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行版）》第4-7 版中均将疏风解毒胶囊作为推荐使用的中成药之一。疏风解毒胶囊在改善发热、干咳、全身乏力等症状、阻断病情进一步发展，特别是在有效缩短病程方面有着良好的疗效[11]。IPA 分析软件是Qiagen 公司开发的一款云计算的生物通路分析软件，基于1 个高度结构化的INGENUITY Knowledge Base 数据库后台，能够查询分析并整合基因、microRNA、蛋白质、基因、代谢组学等多种组学数据的相关信息，具备生物标志物筛选比较、功能注释、生物通路分析、转录调控分析、转录效应分析及作用网络构建等多种分析功能[12]。“网络靶标”——李梢教授首次提出1个新的概念与方法，旨在将病证和药物映射于生物分子网络，然后对复杂疾病与药物干预之间相关性进行网络数据的计算、分析及预测，从而发现药物的药效及其作用机制，对组方用药和疾病治疗的网络药理学研究提供一定的参考[13]。目前将“一靶一药”的研究模式提升为新的“网络靶多组分”的研究模式，以期从总体的角度及分子水平上探究中医药，从而建立了1 种称为NIMS（network target based identification of multi-component synergy）的算法用于分子水平上鉴定协同药物组合的计算方法，对估计协同和促进联合药物开发具有重要意义[14]。网络药理学方法能够对疾病相关的基因进行优先排序，预测中药化合物的靶标及其药理作用，揭示“药物-基因-疾病”模块中相关性信息，通过高通量筛选中药方剂中的多种协同化合物，解释中药方剂的组方原则和网络调节作用[15]。方剂中药成分相对复杂，但借助于现代网络药理学和分子对接技术，能够有效地筛选出药物有效活性成分以及潜在作用靶点[16]。中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP 是由西北农林科技大学王永华教授团队研发的，不仅是1 个可以查找中药数据的平台，更是1 个基于系统药理学研究理论的中药成分筛选分析平台[17]。TCMSP 能够联合运用PubChem 数据库为药物寻找可能的靶点，由于其使用便捷、快速、经济，且不需要高性能计算支持，结果相对准确等特点，已被生命科学各领域的研究人员广泛使用于药物生物活性预测和寻找靶点。但由于网络药理学和分子对接技术是对药物和疾病作用的1种数据整合预测，因此并不能完全依赖于预测结果，仅能提供一定的理论方向，后续仍需要对预测结果进行深入的验证[18]。

表3 疏风解毒胶囊与COVID-19分子网络

图2 疏风解毒颗粒与COVID-19相关基因的分子网络图

沈浮[19]等人和许嘉慧[20]等人研究发现，通过TCMSP和GeneCards 数据库获取疏风解毒胶囊药物靶蛋白和COVID-19 人类基因的交集靶标，分别利用数据分析软 件 Cytoscape 3.7.0 和 Cytoscape 3.7.2 构建 PPI 网 络，运 用 DAVID（Database for Annotation, Visualization,and Integrated Discovery）数据库对靶点进行GO 功能分析（gene ontology enrichment analysis）及KEGG 通路富集分析（KEGG pathway enrichment analysis），结果均提示疏风解毒胶囊中的活性成分能够与相关靶蛋白结合从而激发对应的生物学通路以达治疗COVID-19的作用。GO 功能分析和KEGG 通路富集分析是针对差异基因的富集，而IPA 是对上下调的基因数据有1个动态、交互、实时的整合分析。由于IPA具有准确性高、及时性好、数据全面等特点，已经被生命科学界广泛认可且应用[21-23]。联合运用数据库和IPA 软件分析将COVID-19相关基因与疏风解毒胶囊的活性靶标进行网络拟合与交互，可以探索出疏风解毒胶囊有效活性成分针对COVID-19 治疗的靶点，明确其治疗的分子作用机制。这不仅为生物学通路和靶标提供了新的思路和途径，亦为后续的验证试验提供方向，同时节约了人力、物力和财力，提高了实验的准确性和可行性。

研究发现[24]，血管紧张素转换酶Ⅱ（angiotensin converting enzyme，ACE2）是 SARS-CoV-2 入侵的功能性受体，COVID-19 可以下调ACE2 的表达，使ACE/ACE2 比例失调，从而升高促炎因子的表达，诱发“炎症风暴”，最终导致病情加重。COVID-19 的受体主要有ACE2，但由于疏风解毒胶囊针对COVID-19早期轻度病症，可能通过与ACE2 的结合阻止病毒对宿主的侵染的作用机制有待进一步研究[25]。

图3 疏风解毒胶囊与COVID-19共同作用的生物通路

图4 疏风解毒胶囊活性成分靶蛋白和COVID-19相关基因共同作用IL-8信号通路作用位点

本研究分析结果显示，疏风解毒胶囊活性成分与COVID-19 相关基因构建的分子网络庞大且多样化，相关的生物学功能丰富，但两者仍具有交集。基于生物学通路分析的结果，提示COVID-19 相关基因与疏风解毒胶囊有效活性成分的生物学通路主要集中在炎症、免疫以及细胞增殖、凋亡和迁移相关通路，这也与COVID-19早期推荐使用的中成药疏风解毒胶囊的相关试验一致[26-28]。IL-8 是1 种具有多项功能的特异性细胞因子，在一定程度上能够反映肺损伤的程度[29]。IL-8 亦能够激活中性粒细胞，并使中性粒细胞发生形状改变、游走、进入炎症组织，应起呼吸爆发，生成活性氧代谢物以至引起组织浸润等一系列反应等，在炎性反应中起至关重要的作用[30]。由此进一步深入分析IL-8 信号生物学通路，分析结果发现疏风解毒胶囊可能通过 CXCR1、MMP2、MMP9、EGFR、PI3K 及 AKT 等位点来干预COVID-19 的信号通路。其中CXCR1 属于促炎多肽性细胞因子家族的成员之一，位于细胞膜的脂质上，够与炎症信号白介素8 结合。其通常由位于造血微环境中的基质细胞所分泌，可以激活并趋化体内白细胞的运动[31]。研究表明，CXCR1 可通过细胞内的G 蛋白趋化免疫细胞，激活多种炎性因子的表达[32]。MMP2 和 MMP9 同属于 MMP 基因家族的成员，MMP2可以切割细胞外基质的成分以及参与信号转导的分子；MMP9具有降解细胞外基质的作用，从而促使细胞的迁徙、转移。多项研究表明，通过下调MMP2和MMP9 的表达，可以抑制细胞的增殖、迁移[33，34]。AKT即PKB，是一种特异性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，参与大脑、心脏、肺和皮肤等多种人体组织中细胞生长和增殖的正常调节，在细胞的存活和凋亡中起着重要作用。EGFR 是表皮生长因子受体家族成员之一，是由胞内、胞外、跨膜结构域组成的糖蛋白。在入侵宿主细胞时，在很大程度上病毒需要依赖于特异性结合的细胞表面受体，只有病毒识别到这些表面受体，将立即激活附着、摄取、胞内运输以及渗透到细胞质溶胶等一系列胞内机制[35]。表皮生长因子（EGF）与EGFR结合后通过其胞内结构域的自磷酸化促进受体二聚体激活，进而启动PI3K 的PI3K/AKT 信号通路[36]。已有多项报道表明，PI3K-Akt 信号通路在SARS-CoV 和MERS-CoV 的感染过程中起到重要作用，并可能作为抵御冠状病毒的药物靶标[37，38]。

综上所述，推测疏风解毒胶囊可能通过炎症、免疫反应以及细胞增殖、凋亡和迁移密切相关的通路达到治疗COVID-19 的作用，其作用机制可能与趋化免疫细胞、激活多种炎性因子的表达以及抑制病毒等方面有关。本研究利用网络药理学方法对疏风解毒胶囊改善COVID-19 的分子网络、作用通路及靶点进行预测，初步提示了疏风解毒胶囊干预COVID-19 的分子机制，为疏风解毒胶囊治疗COVID-19 的机制研究提供了一定的依据，亦为后续验证研究提供新的思路。