灵芝多糖对糖尿病肾病小鼠肾小管上皮细胞间充质转化的抑制作用

钟涛 张国新 周迪夷

[摘要] 目的 探讨灵芝多糖对糖尿病肾病（DN）小鼠肾小管上皮细胞间充质转化（EMT）的影响。 方法 将40只C57BL/KsJ-db/db小鼠按体重随机分为5组，每组8只。正常组给予普通饲料喂养。模型组、灵芝多糖（GLP）低（100 mg/kg）、高（400 mg/kg）剂量组和厄贝沙坦组（50 mg/kg）给予高糖饲料喂养，DN小鼠造模成功后，各组每日灌胃给药，持续8周，测定各组小鼠肾功能、血脂等生理指标变化;取肾组织HE染色观察GLP对小鼠肾脏病理改变的影响，用Western blot和实时荧光定量PCR实验检测E-cadherin、α-SMA、TGF-β1、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin、p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3蛋白表达及mRNA水平。 结果 与模型组比较，GLP低、高剂量组血脂代谢及肾功能升高（P < 0.05）。与模型组比较，GLP低、高剂量组及厄贝沙坦组E-cadherin蛋白及mRNA水平升高，而α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin蛋白及mRNA水平降低（P < 0.01）。Smad2、Smad3总蛋白表达水平无变化。 结论 GLP可能通过调节TGF-β1/Smad信号通路，抑制DN小鼠的EMT。

[关键词] 灵芝多糖;上皮细胞-间充质转化;糖尿病肾病;TGF-β1/Smad信号通路

[中图分类号] R587.24          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）02（c）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of ganoderma lucidum polysaccha-ride （GLP） on epithelial-to-mysenchymal transition （EMT） of renal tubular epithelial cells in diabetic nephropathy （DN） mice. Methods Forty C57BL/KsJ-db/db mice were randomly divided into 5 groups by weight. Normal group was fed with normal feed. Model group， GLP low （100 mg/kg）， high （400 mg/kg） dose groups and Irbesartan group （50 mg/kg， Irbesartan） were given high-sugar dieat. Each group was given the drug by gavage daily for 8 weeks after successful modeling of DN mice. The changes of renal function， blood lipid and other physiological indexes were measured. The protein expression and mRNA level of E-cadherin， α-SMA， TGF-β1， Fibronectin， Vimentin， N-cadherin， TGF-β1， p-Smad2， p-Smad3， Smad2 and Smad3 were measured by Western Blot and Real-time PCR. Results Compared with the model group， the renal function and blood lipid metabolism in GLP low and high doses group were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the model group， the levels of E-cadherin protein and mRNA were increased in the GLP low and high doses group and the Irbesartan group， while the levels of α-SMA， Fibronectin， Vimentin， N-cadherin protein and mRNA were decreased （P < 0.01）. The expression levels of Smad2 and Smad3 were unchanged. Conclusion GLP inhibits EMT maybe via inhibition of TGF-β1/Smad signaling pathway.

[Key words] Ganoderma lucidum polysaccharide; Endothelial to mesenchymal transition; Diabetic nephropathy; TGF-β1/Smad signaling pathway

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的严重的微血管病变并发症[1-2]，肾间质纤维化是其主要病理变化之一[3]，其初始环节之一是肾小管上皮-间充质转化（endothelial to mesenchymal transition，EMT）[4-5]，而转化生长因子-β1（TGF-β1）是其发生的重要诱导因子[6]。灵芝多糖（ganoderma lucidum polysaccharide，GLP）具有降血糖、免疫调节等活性[7-8]。因此，本研究通过给予DN动物模型不同剂量的GLP，观察GLP对DN的保护作用，从TGF-β1/Smad通路探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级2型糖尿病（T2DM）模型C57BL/KsJ-db/db雄性小鼠40只，购于上海斯莱克动物实验有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0015。饲养于浙江中医藥大学动物实验研究中心，实验饲养室许可证号SYXK（浙）2013-0184。动物饲养条件：温度（25±1）℃，相对湿度50%～70%。

1.2 试剂与药品

GLP，纯度>95%杭州众芝康菇生物技术有限公司（Johncan International），批号：GK221020。

1.3 方法

1.3.1 动物造模及给药  适应性喂养2周后，32只小鼠给予高糖高热量饲料，另8只小鼠，作为正常组，给予普通饲料喂养。1周后小鼠尾静脉采血，以空腹血糖>11.1 mmol/L，尿微量白蛋白>20 mg/L，判定DN小鼠模型造模成功。每日灌胃给药，持续8周。分为正常组、模型组、GLP低（100 mg/kg）、高（400 mg/kg）剂量组、厄贝沙坦组（50 mg/kg），每组8只。

1.3.2 指标测定及肾脏病理学观察  测定各组小鼠体重、摄食量、饮水量、尿量。腹主动脉采血，3500 r/min（离心半径22 cm），离心15 min，取血清，7020 full automatic biochemical analyzer（Hitachi，Japan）测定血清葡萄糖、胰岛素、肌酐、尿素氮、血脂;检测试剂盒（Jiangcheng，China），测定尿酸、尿肌酐、尿微量蛋白。提取肾脏组织，称重，计算肾脏指数及肌酐清除率，部分用于石蜡切片，HE染色后于400×光镜下观察。

1.3.3 实时荧光定量（Real-time）PCR及Western blot实验  采用Real-time PCR检测肾脏组织E-cadherin、α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin、TGF-β1的mRNA表达水平，以GAPDH为内参，相对表达量（2-△△Ct）值表示目的基因的表达水平。用Western blot法检测E-cadherin、α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3的蛋白表达水平，以GAPDH为内参，并计算灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GLP对DN小鼠代谢的影响

模型组小鼠的体重、肾脏指数、空腹血糖、摄食量、饮水量及尿量高于正常组（P < 0.01）;与模型组比较，GLP低、高剂量组及厄贝少坦组小鼠的体重、肾脏指数、空腹血糖、摄食量、饮水量及尿量降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 GLP对DN小鼠肾功能的影响

模型组小鼠的肌酐清除率、尿肌酐、血肌酐、尿酸、尿微量蛋白、血清胰岛素、尿素氮高于正常组（P < 0.01）;与模型组比较，GLP低、高剂量组及厄贝沙坦组肌酐清除率、尿肌酐、血肌酐、尿酸、尿微量蛋白、血清胰岛素、尿素氮降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 GLP对DN小鼠血脂代谢的影响

与正常组比较，模型组小鼠总胆固醇，三酰甘油和低密度脂蛋白升高，而高密度脂蛋白降低（P < 0.01）;与模型组比较，GLP低、高剂量组及厄贝沙坦组小鼠总胆固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白降低，而高密度脂蛋白升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表3。

2.4 GLP对DN小鼠肾小球病变的影响

与正常组比较，模型组小鼠肾小球系膜基质明显增多，肾小球内细胞也明显增多;与模型组比较，GLP低、高剂量组及厄贝沙坦组小鼠肾小球系膜基质及肾小球内细胞均明显减少。见图1。

2.4 GLP对DN小鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响

与正常组比较，模型组E-cadherin蛋白及mRNA水平降低（P < 0.01），而α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin蛋白及mRNA水平升高（P < 0.05）;与模型组比较，GLP低、高剂量组及厄贝沙坦组E-cadherin蛋白及mRNA水平升高，而α-SMA、Fibronectin、Vimentin、N-cadherin蛋白及mRNA水平降低（P < 0.01）。Smad2和Smad3总蛋白表达水平无变化。见图2、表4。

3 讨论

肾间质纤维化是糖尿病肾病主要病理变化之一[3，11]。文献常采用肾脏指数、肌酐清除率、尿肌酐等指标反映肾功能[12]。糖尿病肾病患者的血脂代谢往往紊乱[13-15]，从而加重肾组织的损伤。本研究中，GLP干预后，肾功能指标、血脂代谢较模型组有所改善，肾脏病理切片也显示干预后小鼠的肾损伤得以减轻。

TGF-β1/Smad信号通路激活是DN发展的主要机制[9-10]，多方面参与肾小管EMT的发生过程[16-17]，会出现上皮细胞标志物E-cadherin丢失、间充质细胞标志物α-SMA的增长[18]，而下调TGF-β1/smad信号通路可以抑制该过程[19-24]。本研究中，模型组上皮细胞标志物降低、间充质细胞标志物升高，TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3水平降低，而GLP干预后，上述变化得以逆转，提示GLP可能通过调节TGF-β1/smad信号通路抑制EMT的过程。

综上，GLP抑制高糖刺激下肾小管上皮细胞发生EMT，其机制可能是通过调节TGF-β1/smad信号通路来完成的。研究结果为其用于糖尿病肾病临床治疗的进一步研究提供理论依据。

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（收稿日期：2019-09-02  本文编辑：刘永巧）