脱糖方式对山楂中特征成分含量的影响

王菲菲，高山，牟德华, *

1. 河北科技大学生物科学与工程学院（石家庄 050000）；2. 河北省食品质量与安全检测技术创新中心（石家庄 051130）

山楂是一种传统的药食两用的植物果实，主要含有碳水化合物、有机酸、果胶及丰富的活性物质等[1-2]，其中抗坏血酸含量6%～8%[3]，是橙子的3倍，柠檬酸作为山楂中含量最多的有机酸，含量2%～3%[4]、山楂酸含量2.01%～2.67%[5]、总黄酮含量2.40%～8.96%[6-8]、多酚含量3.75%～4.23%[9-10]、果胶含量3%～4%[11]，居水果之首；有研究报道证实山楂的果实、叶子和花的提取物对心血管系统具有治疗作用，包括心血管保护，降血压活性，降胆固醇血症和降血脂作用[12-14]。张明等[15]提取山楂黄酮，研究其降血脂功效，试验结果表明山楂黄酮提取物能降低大鼠血脂中的TC、LDL含量，对TG、HDL有调节作用。陈希苗等[16]体外模拟胃肠消化中山楂多酚及抗氧化活性的变化，发现样品抗氧化能力与多酚含量呈正比，并发现山楂游离酚是其抗氧化能力的主要贡献者。

山楂中含有相当一部分糖，李环等[17]用DNS法测得山楂片中还原糖含量约3.7%，宋迪燊等[18]用2, 4-二硝基酚分光光度法测得山楂片还原糖含量为3.66%，郭强[19]用间接原子吸收法测得山楂中还原糖的量约7.68%。高含量的糖限制山楂类制品在糖尿病和“三高”人群中的推广，使得山楂制品容易受温度、湿度、空气、细菌等的影响而降低产品的货架期，成为多种山楂食品开发瓶颈[20]。

为制备一款低糖或无糖型山楂制品，通过比较脱糖前后糖含量变化，综合考虑山楂中特征指标性成分[21]，如绿原酸、花青素、原花青素、表儿茶素、槲皮素等含量变化情况，拟寻找一种在尽可能保留其中特征性成分前提下效果最好的脱糖方法。

1 材料与方法

1.1 材料

干山楂片（神威药业（石家庄）中药饮片有限公司）。

D001、D002、D006、002CR、732树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；KDLY 16酿酒酵母、KDLY 6酿酒酵母（实验室自筛）；诺盟、SC（法国进口酿酒干酵母）；安琪酿酒酵母（安琪酵母（伊犁）有限公司）。

1.2 试剂

氢氧化钠、硫酸铜、次甲基蓝、甲酸试剂（均为分析纯）；柠檬酸钠（试剂级）；盐酸（试剂级）；乙腈（色谱纯）；95%乙醇（食用级）；葡萄糖氧化酶（酶活231 U/mg，上海源叶生物科技有限公司）。

1.3 仪器

LC-20 AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；光电二极管阵列紫外可见光检测器（岛津制作所）；THZ-82 A水浴恒温振荡器（常州荣华仪器制造有限公司）；Adventurer分析电子天平（美国奥豪斯仪器有限公司）；DEL7A320 pH计（上海展仪仪器设备有限公司）。

1.4 样品的制备

取干山楂片，按照料液比1︰10 g/mL的比例向其中加入去离子水，在60 ℃水浴锅中加热煮2 h，2层滤纸过滤，得到山楂原液。

1.4.1 葡萄糖氧化酶法

参考许培振等[22]的方法，取50 mL山楂原液，用20%柠檬酸钠缓冲溶液调节体系pH 5.5，以28 U/L的量向其中加入葡萄糖氧化酶，在39 ℃水浴条件下酶解2 h，100 ℃煮沸10 min，得到葡萄糖氧化酶处理组溶液，冷却后用去离子水定容至100 mL。

1.4.2 树脂吸附法

活化树脂，分别取D001，D002，D006，002CR，732型树脂各5 g于5个锥形瓶中，用去离子水洗净，洗至出水清澈无浑浊，无杂质为止。用95%乙醇浸泡4 h，用去离子水洗净，用5% NaOH溶液浸泡2 h，用去离子水洗至pH 6。用5% HCl溶液浸泡2 h，用去离子水洗至pH 6，得到活化后的树脂。

向活化后的树脂中分别加入50 mL山楂原液，封上保鲜膜，在室温条件下静态吸附12 h，混匀后过滤得到待测样品。

参考张维科等[23]树脂再生方法中的静态再生法，再生液用5%的HCl溶液，按照料液比1︰5 g/mL的比例多次浸泡树脂，每次浸泡4 h，浸泡3次以上，用去离子水冲洗至中性。

1.4.3 乙醇沉淀法

参考孙文娟等[24]的方法，准确量取30 mL山楂原液，分别向其中加入乙醇体积分数为0，40%，50%，60%，70%和80%的90 mL，在40 ℃条件下醇沉5 h，抽滤得到待测样品。

1.4.4 发酵法

取15 g山楂3份，分别放入3个三角瓶中，向其中各加入150 mL沸水，在室温下冷却，冷却至40 ℃左右，向其中加入20 U果胶酶，接入酵母菌5×106CFU/mL，在25 ℃条件下发酵6 d。

1.5 脱糖率和特征成分保留率的计算方法

采用不同方法进行脱糖处理，检测处理后山楂原液中的总糖、还原糖、绿原酸、花青素、原花青素、表儿茶素及槲皮素等指标。总糖和还原糖用直接滴定法进行测定，其他指标用高效液相色谱法测定[25]。脱糖率和特征成分保留率按照式（1）～（3）进行计算。

式中：s0为脱糖前山楂原液中糖含量，g/L；s1为脱糖后山楂原液中糖含量，g/L；At0为脱糖前特征成分峰面积总和；At1为脱糖后特征成分峰面积总和；A0为脱糖前特征成分单体峰面积；A1为脱糖后特征成分单体峰面积。

1.6 数据处理

试验所得数据由Excel 2017软件进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 不同脱糖方法总糖和还原糖的变化

图1为不同脱糖方法对总糖和还原糖的脱除效果。葡萄糖氧化酶法的总糖和还原糖脱除率在20%～25%（图1A）。徐雅琴[26]用葡萄糖氧化酶法脱除蛋粉中葡萄糖，其脱糖率可高达95%以上。其主要原因是蛋粉中糖的种类单一，且含糖量低，葡萄糖氧化酶作用充分[27-32]，而山楂作为水果，含有较多葡萄糖和果糖，葡萄糖氧化酶反应时间短，对其作用效果不明显。因此，葡萄糖氧化酶法更适用于还原糖种类单一且含量较低食品的脱糖方法。

树脂吸附法中，总糖和还原糖脱除效果较好的树脂是D001阳离子交换树脂，其总糖和还原糖脱除率分别为32.63%和33.02%，所有树脂的总糖和还原糖脱除率在15%～34%（图1B）。树脂吸附法对总糖的脱除效果较好，对还原糖的脱除效果差，其原因是多糖本身的大分子骨架进入阳离子交换树脂表面的网状结构中难以洗脱所致[33]，而还原糖的分子结构较小，其中含有的羟基和醛基在水溶液中不容易电离，所以不容易和阳离子交换树脂中的H+进行交换，导致还原糖的脱糖效果较差。树脂吸附作为一种分离纯化的方法，其效果受树脂本身和被吸附物质的结构、被吸附溶液的浓度、pH[34]、温度等多种因素的影响，试验中，该方法的脱糖率偏低，说明这5种树脂均不适用于工业脱糖。

乙醇沉淀法处理后，还原糖的脱除效果始终高于总糖，其还原糖脱糖率在20%～30%，总糖脱除率在15%～20%（图1C），80%的乙醇沉淀效果最好，其总糖和还原糖脱除率分别为21.15%和30.51%。多糖作为一种多羟基的醛或酮，溶于水形成大量的氢键，加入乙醇会破坏溶液中的氢键，降低多糖在水中的溶解度，使多糖以沉淀的方式析出。程莹等[35]用乙醇沉淀法提取桑叶多糖，结果发现60%乙醇沉淀所得桑叶多糖产率最高，而40%乙醇沉淀所得桑叶多糖纯度最高；殷茹等[36]采用乙醇沉淀法脱除大豆粉末磷脂中的糖，得到最佳乙醇脱糖浓度为59%，说明多糖在乙醇溶液中分级沉淀现象。

图1 不同脱糖方法的脱糖效果

发酵法处理后，5种酵母菌的脱糖效果相差不大，其还原糖和总糖的脱糖率分别能达80%和90%以上（图1D）。其中，KDLY 16的还原糖和总糖的脱糖率分别达86.66%和96.82%，为五种酵母菌中脱糖率最高。酿酒酵母在无氧条件下可消耗山楂及其提取液中的糖，发酵产生二氧化碳和酒精。崔淑芬等[37]用酿酒发酵法脱除木糖母液中的葡萄糖，结果发现发酵后葡萄糖脱除率达90.75%；郭小宇等[38]利用酿酒酵母L610发酵菊糖生产乙醇，结果发现该酵母对菊芋总糖的利用率最高可达86%，这与试验结果类似，说明发酵法有良好脱糖效果。

2.2 主要特征性成分的总保留率

从表1中可以看出，葡萄糖氧化酶处理过后特征性成分总保留率达120.86%，其次是发酵法，其总体特征性成分的保留率能达103.95%。葡萄糖氧化酶法作用前后特征性成分在原来的基础上增加20.86%，由图2a可以看出，葡萄糖氧化酶作用后5种特征性成分中槲皮素和花青素含量增高很明显。根据葡萄糖氧化酶的作用机理，葡萄糖氧化酶在氧化葡萄糖的过程分为2步：葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸内酯，葡萄糖酸内酯再自发降解为葡萄糖酸。降解生成的葡萄糖酸结构中含有羰基和大量的羟基，这与所测的特征成分中槲皮素和花青素等成分的结构相似，导致特征性成分的测出量偏高[29]。KDLY 16酵母菌在发酵后特征性成分在原来基础上增加3.95%，山楂提取液在发酵的过程中，其中的葡萄糖、果糖等会被酵母菌利用，代谢生成一部分特征性成分[39-40]。树脂吸附法的特征性成分保留率最高达37.49%，其原因是这些特征成分在水溶液中发生电离，与阳离子交换树脂中的H+交换，导致大部分的特征成分吸附到树脂上[41-42]。乙醇沉淀法中，随着乙醇体积分数升高，特征性成分保留率也在逐渐增大，在乙醇体积分数80%时也只能达20.25%，远低于发酵法。有研究报道表明，乙醇体积分数会在一定程度上影响黄酮类成分的保留率，在乙醇沉淀的过程中，部分特征成分会随着多糖及溶液中的杂质一并沉淀，造成一定损失[43-44]。

表1 不同的脱糖方法处理后特征性成分的总保留率

2.3 不同脱糖方法处理后特征性成分单体的保留率

图2 不同的脱糖方法处理后特征性成分单体的保留率

从图2中可以看出，除了葡萄糖氧化酶法（图2A）和发酵法以外，其他脱糖方法都会使绿原酸和花青素等特征性成分含量有所降低。树脂吸附法处理后，5种特征性成分含量明显降低（图2B）。其中，D002对特征性成分中的原花青素保留率最高，达44.84%，732型阳离子交换树脂对各种成分的保留率最低，原因可能在于不同的阳离子交换树脂的极性不同，再加上不同特征成分本身在溶液中的电离程度不同，导致不同树脂对不同特征成分的保留率有所差别。相对而言，732型阳离子交换树脂是一种磺酸化苯乙烯系凝胶型强酸性阳离子交换树脂，它在不同溶液中都能表现出强大的离子交换功能，所以试验中该树脂处理过的溶液特征成分保留率偏低[45]。乙醇沉淀法中，80%乙醇处理组的槲皮素、绿原酸、花青素含量最高（图2C），原花青素含量与60%乙醇处理组保留率无明显区别，70%乙醇处理组的表儿茶素含量显著高于其他浓度的乙醇处理组，达41.85%。

发酵法的特征性成分保留率较高（图2D），KDLY 16、SC、安琪3种酵母菌发酵处理后，5种特征性成分中除槲皮素外，其他4种特征成分的保留率均在50%以上；从图2D中可以看出，KDLY 16酵母发酵后，绿原酸、原花青素和表儿茶素的含量在原来基础上有所提高；安琪酵母发酵后，绿原酸和花青素在原来基础上有所提高。在发酵的过程中，酵母菌会释放出一部分的次级代谢产物如乙醛、丙酮酸等，这些物质会和黄酮类物质反应，生成大分子衍生物，因此导致部分黄酮类特征成分的含量降低[46-47]。另外，用不同菌种发酵可以得到特定产物，Xiao等[48]以植物乳杆菌B1-6为发酵剂发酵大豆乳清，结果发现该发酵过程能使其中的酚酸和异黄酮苷含量在原来基础上有所提高。

4种脱糖方法各有优缺点，如表2所示，相比较而言，发酵法最适合用于工业脱糖，其脱糖效果在80%以上，远高于其他3种方法，并且特征性成分保留率高。

表2 不同脱糖方法的优缺点

3 结论

探讨的4种脱糖方法还原糖和总糖的脱糖率最高，分别达86.66%和96.82%，最低为18.64%和14.42%，4种脱糖方法之间有显著差别。与其他2种方法相比较而言，葡萄糖氧化酶法、树脂吸附法和乙醇沉淀法的脱糖率偏低，树脂吸附法和乙醇沉淀法会使特征性成分损失较多，不利于在工业生产中大规模应用。尽管葡萄糖氧化酶法对特征性成分的含量不会造成太大的影响，但由于其脱糖效果不明显，也不利于在工业上使用。发酵法由于其脱糖率较高，特征性成分的保留率高等优点，在工业脱糖的应用上具有很大优势。

山楂中的黄酮和多酚类化合物具有改善心血管系统、降低血压、降低血脂、促进消化、养胃保肝、防止氧化，并对细菌、病毒和肿瘤都有一定抑制作用[6,49-50]，这些作用的发挥离不开山楂中一些特征性成分。通过对比不同脱糖方法，找到一种脱糖效果好，同时特征性成分保留率高的方法。使用该方法可有效脱除山楂制品中的糖类物质，拓宽山楂制品的可食用人群，实现山楂制品的多种加工方式，为山楂制品的开发提供理论依据。