衢枳壳提取物改善2 型糖尿病db/db 模型小鼠肾脏氧化损伤的作用研究

郑 慧 王思为 钟松阳 楼丽君

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2 型糖尿病最严重的并发症之一，发病率20%～40%[1]。研究表明，DN 已成为导致终末期肾脏病的重要因素，并会引起多器官衰竭和死亡[2]。DN 的发病机制复杂，目前尚缺乏有效的治疗方法。衢枳壳，即常山胡柚片，是芸香科植物常山胡柚Citrus changshan huyou Y.B.Chang 的干燥未成熟果实的加工品[3]。本研究组前期研究表明，衢枳壳的主要成分为柚皮苷、新橙皮苷等黄酮类化合物，具有抗炎、降糖等多种药理学活性[3-4]。本研究拟通过2 型糖尿病db/db 模型小鼠观察衢枳壳提取物对其肾脏的保护作用并探讨可能的机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性自发性2 型糖尿病C57BLKS/J db/db 模型小鼠，Stock No:000642，7～8 周龄，体质量30～40g；同遗传背景C57BLKS/J db 野生型小鼠（db/m），7～8 周龄，体质量18～22g，以上动物购自南京大学—南京生物医药研究院，动物生产许可证号：SYXK（苏）2015-0001。饲养于浙江中医药大学实验动物中心，自由摄食及饮水。动物实验经浙江省衢州市人民医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 药物及制备 衢枳壳饮片购自衢州南孔中药有限公司。衢枳壳提取物（Quzhou Fructus Aurantii extract，QFAE）制备：称取衢枳壳饮片1kg 净制，粉碎，加15 倍量的80%乙醇（15000mL），浸泡1h，加热回流提取3 次，每次2h，合并提取液，冷却过滤，滤液回收溶剂，冷冻干燥，即得QFAE。所得QFAE 中黄酮类化合物的含量≥50%。

1.3 主要试剂及仪器 血糖试纸，购自美国强生，批号Lot4 525469；肌酐（Cr）检测试剂盒（批号20181207）、尿素氮（BUN）检测试剂盒（批号20181207）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（批号20190428）、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（批号20190428）和还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（批号20190428），均购自南京建成生物工程研究所；Trizol 试剂（美国Invitrogen，批号Lot△S7130）；cDNA逆转录试剂盒（美国Thermo Fisher，批号Lot：00742498）；SYBR Green 试剂盒（上海生工，批号F708KA2311）。7020 全自动生化分析仪，日本日立；高速冷冻离心机，美国Thermo；LC480 荧光定量PCR仪，美国罗氏。

1.4 动物分组及给药 24 只C57BLKS/J db/db 雄性小鼠适应性饲养1 周后，采用随机数字表法分为模型组，QFAE 低、高剂量组，每组8 只。另取8 只C57BLKS/J db 野生型小鼠作为对照组。对照组和模型组小鼠每天以蒸馏水灌胃，QFAE 低、高剂量组小鼠每天按QFAE 100、300mg/kg 剂量灌胃，连续喂养7 周，每周记录小鼠体质量和血糖情况。末次给药24h 后处死小鼠，收集血清、肾脏。

1.5 检测指标

1.5.1 生化指标测定 全自动生化仪上测定各组小鼠血清Cr 和BUN 水平；取小鼠肾脏匀浆，根据试剂盒操作要求，检测肾组织匀浆氧化应激指标SOD、CAT 和GSH 的活性。

1.5.2 肾组织病理学观察 取各组小鼠一部分肾脏组织，用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，400 倍显微镜下观察。

1.5.3 RT-PCR 检测 采用Trizol 法提取各组小鼠肾脏RNA，并逆转录为cDNA。按照SYBR Green 荧光染料法进行定量PCR 测定，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列如下：Gclm 上游序列5'-CTTCGCCTCCGATTGAAGATG-3'，下游序列5'-AAAGGCAGTCAAATCTGGTGG-3'；Nqo1 上游序列5'-AGGATGGGAGGTACTCGAATC-3'，下游序列5'-TGCTAGAGATGACTCGGAAGG-3'；Gclc 上游序列5'-CTACCACGCAGTCAAGGACC-3'，下游序列5'-CCTCCATTCAGTAACAACTGGAC-3'；GAPDH 上游序列5'-TGAGGCCGGTGCTGAGTATGT-3'，下游序列5'-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。PCR 反应条件：95℃30s 1 循环，95℃5s 40 循环，60℃31s 40 循环，采用2-ΔΔCt 法进行半定量分析。

1.6 统计学方法 所有数据均用SPSS 17.0 统计软件进行处理，数据以均值±标准差（）表示，组间差异按方差分析进行检验，并用最小显著差法检验作两两比较，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 QFAE 对db/db 模型小鼠血糖、体质量和肾质量的影响 与对照组比较，模型组小鼠血糖、体质量和肾质量显著增高（P 均<0.05）；与模型组比较，QFAE低、高剂量组小鼠血糖、体质量无明显变化（P＞0.05），但肾质量显著低于模型组（P 均＜0.01），见表1。

表1 各组小鼠血糖、体质量和肾质量比较（）

表1 各组小鼠血糖、体质量和肾质量比较（）

注：对照组予蒸馏水灌胃；模型组予蒸馏水灌胃；QFAE 低剂量组予100mg/kg 剂量QFAE 灌胃；QFAE 高剂量组予300mg/kg 剂量QFAE灌胃；QFAE 为衢枳壳提取物；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.01

2.2 QFAE 对db/db 模型小鼠血清Cr 和BUN 水平的影响 与对照组比较，模型组小鼠血清Cr 和BUN水平显著升高（P 均＜0.05）；与模型组比较，QFAE低、高剂量组小鼠血清Cr 和BUN 水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01），见表2。

2.3 QFAE 对db/db 模型小鼠肾组织病理学的影响对照组小鼠肾组织结构完整，无明显组织病理学改变；模型组小鼠肾小球出现萎缩和碎裂，肾小管变性和坏死；QFAE 喂养能一定程度改善以上病理学变化，尤其高剂量效果显著。见图1。

表2 各组小鼠血清Cr 和BUN 水平比较（）

表2 各组小鼠血清Cr 和BUN 水平比较（）

注：对照组予蒸馏水灌胃；模型组予蒸馏水灌胃；QFAE 低剂量组予100mg/kg 剂量QFAE 灌胃；QFAE 高剂量组予300mg/kg 剂量QFAE灌胃；Cr 为肌酐；BUN 为血清尿素氮；QFAE 为衢枳壳提取物；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

图1 各组小鼠肾组织病理学改变（HE 染色×400）

2.4 QFAE 对db/db 模型小鼠肾组织SOD、GSH 和CAT 活性的影响 与对照组比较，模型组小鼠肾组织SOD、GSH 和CAT 活性显著降低（P 均＜0.05）；与模型组比较，QFAE 低、高剂量组小鼠肾组织SOD、GSH 和CAT 活性显著增加（P＜0.05 或P＜0.01）。见表3。

表3 各组小鼠肾组织SOD、GSH 和CAT 活性比较（）

表3 各组小鼠肾组织SOD、GSH 和CAT 活性比较（）

注：对照组予蒸馏水灌胃；模型组予蒸馏水灌胃；QFAE 低剂量组予100mg/kg 剂量QFAE 灌胃；QFAE 高剂量组予300mg/kg 剂量QFAE灌胃；QFAE 为衢枳壳提取物；SOD 为超氧化物歧化酶；CAT 为过氧化氢酶；GSH 为还原型谷胱甘肽；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

2.5 QFAE 对db/db 模型小鼠肾组织抗氧化基因Gclm、Nqo1 和Gclc 表达的影响 RT-PCR 结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肾脏抗氧化基因Gclm、Nqo1 和Gclc mRNA 表达降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，QFAE 低、高剂量组小鼠肾组织Gclm、Nqo1 和Gclc mRNA 表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01），见表4。

3 讨论

DN 特征主要包括细胞外基质（ECM）蛋白的积累和不可逆转的肾功能下降[5]。血清Cr 和BUN 水平反应肾小球滤过率，DN 会引起血清Cr 和BUN 水平升高。本研究结果显示，与db/m 模型小鼠比较，db/db小鼠血Cr 和BUN 水平显著升高，且小鼠肾脏出现一定程度的病理学改变。然而，给予不同剂量QFAE后，db/db 模型小鼠SCr 和BUN 水平降低，且肾脏组织的病理损伤缓解，提示QFAE 对db/db 模型小鼠肾损伤具有一定改善作用。

表4 各组小鼠肾组织抗氧化基因Gclm、Nqo1和Gclc mRNA 表达量比较（）

表4 各组小鼠肾组织抗氧化基因Gclm、Nqo1和Gclc mRNA 表达量比较（）

注：对照组予蒸馏水灌胃；模型组予蒸馏水灌胃；QFAE 低剂量组予100mg/kg 剂量QFAE 灌胃；QFAE 高剂量组予300mg/kg 剂量QFAE灌胃；Gclm 为谷氨酸-半胱氨酸修饰亚基；Nqo1 为醌氧化还原酶1；Gclc 为谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基；QFAE 为衢枳壳提取物；与模型组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

氧化应激被认为是DN 发生与发展的重要机制之一。有研究认为，2 型糖尿病肾病与机体氧化损伤及抗氧化防御系统失衡有关[6-7]。正常生理条件下，机体内自由基、过氧化脂质和抗氧化酶之间保持动态平衡。然而，当组织和细胞受到外界环境不利因素刺激（例如高糖高脂环境），会导致机体氧化-还原体系平衡被打破，引起一些抗氧化酶（如SOD、CAT 和GSH 等）活性降低，从而导致组织和细胞氧化损伤[6-7]。药理研究表明，QFAE 的主要成分柚皮苷、新橙皮苷等均具有较强的抗氧化作用[8]。因此，我们认为QFAE可能具有提高db/db 模型小鼠肾脏抗氧化能力的作用。结果显示，与对照组比较，db/db 模型小鼠肾组织抗氧化酶SOD、CAT 和GSH 活性显著降低，而QFAE能够显著提高db/db 小鼠肾组织抗氧化酶SOD、CAT和GSH 活性，减轻肾脏氧化损伤。

Nqo1、Gclc、Gclm 等是参与维持组织、细胞氧化-还原平衡体系的重要基因[9]。研究显示，Nqo1、Gclc、Gclm 能够通过提高SOD、CAT 和GSH 等酶活性，加速自由基的清除，从而抑制细胞氧化应激反应，缓解细胞氧化损伤[10]。本研究结果显示，QFAE 能够显著提高小鼠肾组织抗氧化基因Gclm、Nqo1、Gclc mRNA 表达，提示促进肾组织抗氧化基因表达可能是QFAE 改善db/db 模型小鼠肾脏氧化损伤的主要机制之一。

综上所述，本研究结果表明，QFAE 具有改善2型糖尿病db/db 模型小鼠肾功能，缓解肾损伤的作用，其机制主要与促进抗氧化基因表达，提高肾组织抗氧化能力有关。