转EPSPS+PAT基因大豆向非转基因大豆的基因漂移研究

刘 标，薛 堃，刘来盘，沈文静，郭 慧

(1.生态环境部南京环境科学研究所，江苏 南京 210042；2.中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081)

自1997年商业化生产以来，全球转基因作物的种植面积快速扩大，并产生了显著的经济效益[1]。但是，转基因作物的大规模环境释放也可能产生一系列环境风险，包括转基因作物中外源基因以花粉为媒介向其栽培品种和野生近缘种的基因漂移所引起的风险[2-3]。基因漂移指1个或多个基因从1个孟德尔遗传群体转移到另1个孟德尔遗传群体的现象或者过程[4]。自从转基因作物商业化生产以来，转基因油菜(Brassicanapus)[5]和转基因玉米(Zeamays)[6-7]向其栽培种或者野生近缘种发生基因漂移的现象已经被科学数据所证实，转基因大豆(Glycinemax)、棉花(Gossypiumhirsutum)和水稻(Oryzasaliva)等转基因作物的基因漂移风险越来越引起政府有关管理部门和科学团体的高度重视[8-9]。

栽培大豆(GlycinemaxL. Merr.)为自花授粉的有性繁殖植物，异花授粉率一般低于1%[10]。栽培大豆起源于野生大豆(GlycinesojaSeib. et Zucc.)，我国是世界上最主要的野生大豆生物多样性起源地。栽培大豆与野生大豆虽然同属不同种，但是拥有相同的基因组(染色体均为2n=40)，两者容易杂交且结实性良好，相互之间易于发生基因漂移，而且杂交后代性状的遗传方式与栽培大豆品种间杂交后代的遗传方式相似[11]。自从转基因大豆开展商业化生产以来，不同国家的科学家开展了一系列转基因大豆向栽培大豆和野生大豆基因漂移的研究。这些研究结果表明，耐草甘膦转EPSPS基因大豆可以向不同品种的栽培大豆和野生大豆发生基因漂移，但是异交率一般低于1%[12-15]。对于常规大豆种植面积大且有野生大豆大面积分布的中国来说，开展转基因大豆向栽培大豆和野生大豆基因漂移的评价和研究工作是非常重要的。耐草甘膦和草铵膦除草剂转EPSPS+PAT基因大豆S4003.14是大北农生物技术有限公司研发的转基因作物，阿根廷农业产业部于2019年2月27日批准了表达相同外源基因的转基因大豆DBN-09004-6的种植许可[16]，但是其在我国向非转基因栽培大豆和野生大豆的基因漂移风险尚鲜见报道。笔者参照有关国家标准规定的方法，研究了S4003.14向10个非转基因大豆的基因漂移风险，为评价和控制该转基因大豆可能产生的基因漂移风险提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：耐草甘膦和草铵膦除草剂转EPSPS+PAT基因大豆S4003.14，由北京大北农生物技术有限公司研发和提供；采集自伊通、张家界、海宁、上饶、江浦5个地区的野生大豆；与耐除草剂转基因大豆S4003.14生育期相当的5个非转基因栽培大豆品种(吉育47、吉育69、吉育71、吉育91、东农52)。

1.2 试验地点及时间

试验地点位于吉林省伊通满族自治县西苇林场大北农实验基地(43°15′ N、125°20′ E)，试验地为开垦林地。试验基地所在地区属于中温带大陆季风气候区，四季分明，年平均气温为4.6 ℃，无霜期为138 d，年降水量为627.3 mm，7—8月(大豆花期)以西南风为主，风力3～4级。土壤类型为白浆土。试验地以垄施复合肥〔m(N)∶m(P)∶m(K)=15∶15∶15〕作为底肥。当地田块主要杂草为稗草(Echinochloacrusgalli)、牛筋草(Eleusineindica)和狗尾草(Setariaviridis)等禾本科杂草和反枝苋(Amaranthusretroflexus)、野西瓜苗(Hibiscustrionum)、铁苋菜(Acalyphaaustralis)和苘麻(Abutilontheophrasti)等阔叶杂草。

试验地四周设有围栏同外界隔离。试验地周围以松树(Pinussp.)和柞树(Quercussp.)为主次生林，周围1 000 m范围内无其他大豆种植。该试验事先得到了国家农业转基因生物安全主管部门的批准〔农基安办报告字(2017)第253号〕。

1.3 试验方法

试验依据《转基因植物及其产品环境安全检测 耐除草剂大豆 第3部分：外源基因漂移(农业部2031号公告-3-2013)》和《转基因大豆环境安全检测技术规范(中华人民共和国农业行业标准NY/T 719.1-2003)》执行。

1.3.1转基因大豆S4003.14向非转基因栽培大豆和野生大豆的基因漂移

采用对比法设计试验，耐除草剂转基因大豆S4003.14分别与5种野生大豆和5个非转基因栽培大豆品种依次隔行间作，共设置4个重复(东西向、南北向各2个重复)，株距为8 cm，行距为40 cm(图1)。

方框部分为田间试验地。

转基因耐除草剂大豆S4003.14和10个非转基因大豆均按单行进行播种。为保证转基因大豆与非转基因大豆花期相遇，试验材料分3期播种：第1期耐除草剂转基因大豆S4003.14播种时间为2017年5月5日，第2期耐除草剂转基因大豆S4003.14和非转基因栽培大豆及野生大豆同时于2017年5月12日播种，2017年5月19日进行第3期耐除草剂转基因大豆S4003.14播种。

记录各试验材料的生长情况和完整花期，在非转基因大豆成熟后，收获所有大豆种子，并自然风干保存备用。每个方向每种非转基因大豆随机选取2 000粒外表完整的种子在温室条件下播种并进行聚合酶链式反应(PCR)分子检测。

1.3.2转基因大豆向非转基因栽培大豆基因漂移的距离

在开展转基因大豆向非转基因栽培大豆和野生大豆基因漂移研究的同时，选取非转基因大豆吉育47和耐除草剂转基因大豆S4003.14进行基因漂移的距离和频率试验。试验地块为大于90°的扇形区域(图2)，半径为32 m。扇形区域顶角位于上风口。在扇形顶角处种植耐除草剂转基因大豆S4003.14，种植半径为2 m，扇形的其他部分种植非转基因大豆吉育47。非转基因大豆播种前将扇形分为面积相等的5个亚区，分别标记为A、B、C、D、E，并保证每个亚区在距离转基因耐除草剂大豆种植区1、2、5、10、20和30 m处非转基因大豆均能够出苗，种植行距为40 cm，株距为8 cm。为了保证花期相遇，2017年5月12日播种非转基因栽培大豆，耐除草剂转基因大豆S4003.14分别于2017年5月12日和2017年5月19日进行2次播种。

对试验材料的生长发育和完整花期进行记录。当非转基因大豆成熟时，在距离转基因耐除草剂大豆S4003.14种植区1、2、5、10、20和30 m处取样，每个亚区选择1个样点收获不少于1 000粒的吉育47大豆种子。收获后将同一距离的A、B、C、D、E 5个样点的大豆种子混合备用，分别检测和统计距离S4003.14种植区1、2、5、10、20和30 m处1 000粒种子中含有外源基因的阳性种子数，计算不同距离转基因耐除草剂大豆S4003.14与吉育47的异交率。

同心弧中心部分为转化体材料S4003.14，同心弧线代表不同取样距离。

1.3.3检测方法

将上述试验中选取的种子在温室种植，待出苗并长出第1片真叶后，先喷施草甘膦除草剂(以有效成分计，1 230 g·hm-2)，3 d后再喷施草铵膦除草剂(以有效成分计，600 g·hm-2)，施药后4周记录存活株数，并取存活大豆植株的新鲜叶片进行转基因大豆S4003.14的2个目的基因的PCR分子检测。PCR反应条件为94 ℃ 5 min变性，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s进行30个循环，之后72 ℃保持10 min。目的基因EPSPS和PAT的PCR特异引物见表1。阴性对照为受体材料Jack的DNA，阳性对照为转化体S4003.14的DNA。

表1 目的基因特异引物及特征片段大小

Table 1 Specific primers sequence and fragment size of target gene

基因引物名称引物序列片段大小/bpEPSPSPrimer Ⅰ(CP4-02-F)5′ AAAGACTCCAACGCCAATCACCTACAG 3′288Primer Ⅱ(CP4-02-R)5′ GCAGCAACCAATGGGAAAGCAGT 3′PATPrimer Ⅰ(Pat-F)5′ CCGGAGAGGAGACCAGTTGAGAT 3′227Primer Ⅱ(Pat-R)5′ TTCCAGGGCCCAGCGTAAG 3′

1.4 异交率的计算

根据耐除草剂性状和2个目的基因的PCR分子检测结果确定转基因耐除草剂大豆S4003.14与非转基因大豆的异交率，计算公式为P=N/T×100%。其中，P为异交率；N为检测到的含有2个目的基因的大豆植株数，株；T为播种后大豆出苗总数，株。

1.5 繁殖性状的测定

将前述具有耐除草剂性状和PCR检测结果阳性的F1植株移栽至直径30 cm、高35 cm的盆中，每盆1株，于主茎上挂标签。于温室中培养至结荚鼓粒后，单株套透明尼龙网袋。至完全成熟后整袋干燥，并记录单株的荚数、每荚饱粒数和百粒重等。

2 结果与分析

2.1 耐除草剂转基因大豆S4003.14与非转基因大豆的花期重叠时间

表2显示，3个播种时期耐除草剂转基因大豆S4003.14的花期均为21 d，而3个播种时期耐除草剂转基因大豆S4003.14的花期为2017年7月10日至8月5日，共27 d。每个非转基因大豆的花期与耐除草剂转基因大豆S4003.14相似，5个非转基因栽培大豆的花期为2017年7月10日至8月3日，共25 d，与3个播种时期耐除草剂转基因大豆S4003.14的花期重叠25 d。野生大豆花期约为35 d，5个野生大豆的花期为2017年7月7日至8月25日，与3个播种时期耐除草剂转基因大豆S4003.14的花期重叠27 d。可见，耐除草剂转基因大豆S4003.14与10个非转基因大豆在花期上有17～27 d的重叠时间，为耐除草剂转基因大豆S4003.14向10个非转基因大豆发生基因漂移提供了可能性。

表2 耐除草剂转基因大豆S4003.14与非转基因大豆的花期重叠时间

Table 2 Flowering overlaps of herbicide-tolerant transgenic soybean S4003.14 and non-transgenic soybean

A为耐除草剂转基因大豆S4003.14，B为野生大豆，C为非转基因栽培大豆，t为与S4003.14花期重叠时间。“—”表示无数据。

2.2 耐除草剂转基因大豆S4003.14向非转基因大豆基因漂移的异交率

将收获的10个非转基因大豆种子种植于温室中并先后喷施草甘膦、草铵膦2种除草剂，记录施药后4周的存活株数，并对存活大豆苗进行PCR分子检测(图3～4)，得出隔行种植条件下耐除草剂转基因大豆S4003.14向10个非转基因大豆发生基因漂移的异交率在0.06%～0.93%之间，其中S4003.14向5个野生大豆基因漂移的异交率范围为0.06%～0.19%，向5个非转基因栽培大豆基因漂移的异交率为0.16%～0.93%(表3～4)。

M为DNA Ladder Marker；CK-为阴性对照(受体材料Jack的DNA)；CK+为阳性对照(转基因植株的DNA)；1～19为施药后存活的大豆植株的DNA。

M为DNA Ladder Marker；CK-为阴性对照(受体材料Jack的DNA)；CK+为阳性对照(转基因植株的DNA)；1～20为施药后存活的大豆植株的DNA。

表3 S4003.14向非转基因大豆发生基因漂移的异交率(东西方向)

Table 3 Outcrossing rates of S4003.14 to non-transgenic soybeans (east-west direction)

非转基因大豆出苗数/株A/株B/株异交率/%伊通野生大豆1 657220.12张家界野生大豆1 685220.12海宁野生大豆1 696220.12上饶野生大豆1 700110.06江浦野生大豆1 617330.19吉育471 8121080.44吉育691 832430.16吉育711 83512120.66吉育911 81512110.60东农521 82211100.55

播种数均为2 000粒。A为喷施除草剂后存活株数，B为PCR检测阳性株数。

相同条件下，耐除草剂转基因大豆S4003.14向5个野生大豆发生基因漂移的平均异交率显著或极显著低于向5个非转基因栽培大豆发生基因漂移的平均异交率(东西方向野生大豆与非转基因栽培大豆比较P=0.016，南北方向野生大豆与非转基因栽培大豆相比较P=0.006，所有野生大豆与非转基因栽培大豆相比较P=0.001)，且南北方向种植的耐除草剂转基因大豆S4003.14向野生大豆和非转基因栽培大豆品种的平均异交率(0.13%和0.65%)比东西方向(0.12%和0.48%)高，这可能与在大豆生长季和花期试验地区以西南风为主有关。

表4 S4003.14向非转基因大豆发生基因漂移的异交率(南北方向)

Table 4 Outcrossing rates of S4003.14 to non-transgenic soybeans (north-south direction)

非转基因大豆出苗数/株A/株B/株异交率/%伊通野生大豆1 705330.18张家界野生大豆1 664110.06海宁野生大豆1 658220.12上饶野生大豆1 771220.11江浦野生大豆1 675430.19吉育471 81713120.66吉育691 819650.27吉育711 73816160.93吉育911 74913130.74东农521 74211110.63

播种数均为2 000粒。A为喷施除草剂后存活株数，B为PCR检测阳性株数。

2.3 耐除草剂转基因大豆S4003.14向非转基因栽培大豆基因漂移的距离

由表2可知，耐除草剂转基因大豆S4003.14与吉育47的花期重叠时间为21 d，两者之间有发生基因漂移的可能性。对1.3.2节试验中收获的吉育47种子进行温室种植并喷施2种除草剂，结果显示，在喷施2种除草剂1周后，所有试验大豆苗全部死亡。该结果表明在耐除草剂转基因大豆S4003.14与常规大豆吉育47存在21 d花期重叠的情况下，此次试验未在距离大于1 m的农田条件下检测到基因漂移。

2.4 耐除草剂转基因大豆S4003.14与非转基因大豆杂交后代的生长和生殖

2.2节所述既耐草甘膦和草铵膦又经PCR检测含有2个目的基因的大豆个体为耐除草剂转基因大豆S4003.14与非转基因大豆的杂交后代。在温室条件下继续按照常规方式培养这些杂交后代直至结实，结果表明，所有杂交后代均可以正常生长，绝大部分杂交后代还可以正常结实(表5)。

表5 S4003.14与非转基因大豆杂交后代的繁殖数据

Table 5 Reproductive data of hybrids of S4003.14 and non-transgenic soybeans

非转基因大豆耐2种除草剂且PCR检测阳性株数结籽株数/株单株荚数单株饱粒数/粒每荚饱粒数/粒百粒重/g伊通野生大豆54182.5255.01.4019.49张家界野生大豆33136.7200.01.464.84海宁野生大豆43134.3202.31.516.55上饶野生大豆3314.721.31.459.26江浦野生大豆65134.4227.21.6910.76吉育47201749.6124.42.0821.73吉育698766.0110.81.8919.49吉育71282857.5103.11.9315.72吉育91242365.899.21.8720.77东农52211952.8122.91.8821.12

3 讨论

在国家对转基因技术的大力支持下，由大北农生物技术有限公司、上海交通大学、中国农业科学院作物科学研究所等国内科研单位培育的转G10-EPSPS基因抗草甘膦大豆SHZD32-01、转EPSPS和PAT基因抗草甘膦大豆S4003.14、转G2-EPSPS和GAT基因抗草甘膦大豆、抗旱转TaDREB3a基因大豆等发展迅速，部分转基因大豆在技术上已经具备了商业化种植的条件[17-18]。尽管国外进口的转基因大豆在我国已有20余年的安全食用记录，而且国内外已有一些转基因大豆基因漂移方面的研究；但考虑到我国不但是栽培大豆生产大国，而且是世界野生大豆最重要的起源地和分布中心，若我国自主研发的转基因大豆进行商业化种植，需要根据转基因生物安全管理的个案评价原则(case-by-case principle)，对其向非转基因栽培大豆和野生大豆基因漂移的风险进行充分的评估和研究，为管理和控制转基因大豆基因漂移风险提供科学支撑。

基因漂移发生的前提条件是相邻生长且花期相遇[19]。笔者研究结果表明，耐除草剂转基因大豆S4003.14与5个栽培大豆和5个野生大豆花期重叠时间为17～27 d，使转基因大豆S4003.14有足够的时间将其花粉传递给栽培大豆和野生大豆。考虑到栽培大豆在我国不仅种植面积大，而且与野生大豆的自然分布区域高度重叠(笔者在伊通常规栽培大豆田曾经多次发现野生大豆缠绕在常规栽培大豆植株上)，其花粉活力与非转基因大豆无显著差异，使转基因大豆向常规栽培大豆和野生大豆发生基因漂移具备时间和空间上的条件[17]。

在笔者试验隔行(行距为40 cm)种植条件下，耐除草剂转基因大豆S4003.14向5个野生大豆基因漂移的异交率范围为0.06%～0.19%，向5个非转基因栽培大豆基因漂移的异交率为0.16%～0.93%；在中国的另1个隔行种植试验中，转EPSPS基因抗除草剂大豆AG5601与36个非转基因栽培大豆品种的自然异交率为0～0.934%[13]；日本学者NAKAYAMA等[19]开展的1个为期4 a的试验结果也表明，当转EPSPS基因大豆AG3701RR(Event 40-3-2)与非转基因大豆相距0.7 m时，两者之间的基因漂移异交率可达0.19%。笔者试验结果与上述2个研究结果基本一致。笔者试验中在S4003.14大豆与非转基因栽培大豆之间的距离超过1 m的条件下，未检测到基因漂移的发生。而在巴西开展的1个转基因大豆与栽培大豆基因漂移的大田试验中，当非转基因大豆距离转EPSPS基因大豆花粉供体1 m时，平均异交率为0.52%，2 m处的平均异交率为0.12%[12]；陈新等[14]的试验结果显示，转EPSPS基因大豆ARG04与野生大豆之间最远漂移距离为10 m。刘杰等[15]的研究结果表明，转EPSPS基因大豆和不同品种非转基因大豆之间相距5 m处基因漂移频率为0.03%，而在29 m处降至0.001%。笔者研究依据我国有关国家和行业标准，在每个方向上，每种非转基因大豆随机选取2 000 粒外表完整的种子，在温室条件下播种后进行筛选，并进行PCR分子检测。结果表明，转基因大豆与非转基因大豆在距离超过1 m时异交率为0的结果与上述研究结果不同的原因，可能与试验地点的温度、风向、风速、传粉昆虫种类和数量等自然条件不同有关，也可能与所检测样品量偏低有关。虽然增加检测样本量会提高成本，但是可以提高检测数据的精确度和科学性。建议国家有关主管部门修改笔者试验所依据的2个技术标准，适当增加检测样本量，并在0～1 m范围内减小取样间隔距离，以获得更加科学、准确的基因漂移数据。

外源基因通过基因漂移进入非转基因植物后，其对表达该外源基因的非转基因植物的适合度所产生的影响是评价基因漂移可能产生生态风险的核心[9，20]。笔者试验结果和其他相关研究结果表明，虽然转基因大豆向非转基因栽培大豆和野生大豆发生基因漂移的异交率很低；但是，由于栽培大豆在我国种植面积大，野生大豆分布区域与栽培大豆种植区域高度重叠，如果转基因大豆在我国进行长期的大规模种植，外源基因通过花粉向非转基因栽培大豆和野生大豆发生基因漂移是无法避免的。如果向非转基因栽培大豆发生基因漂移，杂交后代的种子被人类收获后主要用作加工原料，其环境风险比较小且更易于控制；如果向野生大豆发生基因漂移，则意味着外源基因会进入主要在自然环境下生长的野生大豆群体之中，可能对野生大豆资源造成无法预料的风险。作物野生种的保护已经引起国际组织和各国政府的高度重视，而野生大豆是我国和世界宝贵的生物遗传资源，外源基因漂移可能对我国野生大豆生物物种资源的影响是转基因大豆在我国商业化生产前必须解决的科学问题之一。从笔者研究结果(表5)来看，耐除草剂转基因大豆S4003.14与10个非转基因大豆杂交所产生的F1种子，绝大部分可以正常萌发、生长并产生种子。已经发表的2个试验结果[21-22]显示，在没有草甘膦的条件下，与母本野生大豆相比，表达EPSPS基因的“转基因大豆-野生大豆”杂交后代(F1和F2)的某些适合度指标没有发生显著变化，在某些适合度参数(尤其是繁殖指标)上甚至显著高于野生大豆，表明表达EPSPS基因的“转基因大豆-野生大豆”杂交后代可能具有更强的环境风险。因此，开展转基因大豆与其近缘种(常规栽培大豆和野生大豆)杂交后代的适合度研究，是今后评价和研究转基因大豆向非转基因大豆发生基因漂移可能引起生态风险的重要内容。

4 结论

根据“个案”原则，笔者对耐除草剂转基因大豆S4003.14与非转基因栽培大豆和野生大豆之间的基因漂移进行研究。结果表明，大田种植条件下，转基因大豆S4003.14与不同品种栽培大豆和野生大豆具有17～27 d的花期重叠时间，并在一定范围内有低频的杂交发生。外源基因可能通过这种方式转移到自然生态系统中，并伴随杂交后代的传代而实现对其他近缘种的渗透。转基因大豆的安全性问题，尤其是野生大豆分布区的生态安全性，需要长期的观察和监测才能更加准确地进行评价。