超声生物显微镜评估大鼠急慢性心肌肥厚模型左心室心肌形态及功能的可行性

周 丽，魏世杰，李 晴，纳丽莎，王 芳，王婷婷

(1.宁夏医科大学总医院心脏中心功能部，2.药剂科，宁夏 银川 750004)

左心室心肌质量增加是心血管疾病的独立危险因素，也是心血管事件的预期指标[1]。交感神经兴奋是心室肥厚形成与发展的重要原因。肾上腺素水平与心肌肥厚程度呈正相关。肾上腺素可用于制作与人类心肌肥厚过程类似的急性代偿性及慢性病理性心肌肥厚动物模型，如皮下连续注射异丙肾上腺素(isoproterenol， ISO)可制作大鼠急性及慢性心肌肥厚模型，已广泛用于心血管疾病发生、转归及疗效评价等研究中[2]。目前主要采用颈动脉插管和手术解剖评价ISO动物模型左心室形态及功能，易致动物死亡而无法进行后续药效学、药动学等实验研究。超声生物显微镜(ultrasound biomicroscopy， UBM)是近年发展的超声新技术，目前已逐渐用于动物实验研究[3]。本研究观察采用UBM测量ISO所致大鼠急性及慢性心肌肥厚模型左心室形态及功能参数的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级雄性健康SD大鼠40只，体质量(280±20)g，动物许可证号：SCXY(宁)2018-0001，以标准饲料喂养1周后进行实验。将大鼠随机分为急性心肌肥厚模型组(急性模型组)、急性对照组、慢性心肌肥厚模型组(慢性模型组)及慢性对照组，每组10只。急性模型组大鼠皮下注射ISO 85 mg/kg体质量，1次/天，连续2天；急性对照组以相同剂量、频次皮下注射生理盐水；慢性模型组皮下注射ISO 5 mg/kg体质量，1次/天，连续7天；慢性对照组以相同剂量、频次皮下注射生理盐水。盐酸ISO原料药纯度>99.0%(批号：90100226)。造模过程中，急性模型组死亡2只，慢性模型组死亡1只，慢性对照组死亡1只。

1.2 仪器与方法 采用Visualsonics Vevo2100高分辨率超声成像系统，MS-250探头，频率20 MHz。腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g体质量)后，仰卧位保定大鼠于鼠板上，以8%硫化钠溶液对胸部心前区褪毛。采用UBM观察胸骨旁左心室长轴切面，使左心室腔尽量呈水平位，以最大化分辨率和最适图像增益清晰显示左心室心内膜、心外膜，取样线尽量垂直置于左心室前壁及后壁乳头肌后缘水平，于二尖瓣关闭前一帧图像测量左心室前壁厚度(left ventricular anterior wall diameter， LVAWD)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall diameter， LVPWD)、左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter， LVEDD)及左心室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter， LVESD)。每只大鼠均连续测量3个心动周期，取平均值作为结果(图1)。设备自动计算获得左心室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume， LVEDV)、左心室收缩末期容积(left ventricular end systolic volume， LVESV)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction， LVEF)、左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening， LVFS)及左心室质量。

图1 UBM测量大鼠左心室参数

1.3 左心室质量测量与病理学检查 超声测量结束后处死大鼠，迅速解剖并摘取心脏，去除心耳及周围结缔组织，分离左心室，以低温生理盐水冲洗干净，滤纸吸干后精密天平称重。取心尖组织置于4%多聚甲醛溶液固定，常规切片、HE染色、镜下观察。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计分析软件。对计量资料进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布、方差齐者以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。采用配对t检验比较UBM所测左心室质量与解剖后精确测量左心室质量。以直线相关分析进行相关性检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 左心室形态及功能参数 急性模型组LVAWD、LVPWD较急性对照组增加(P均<0.05)；慢性模型组较LVAWD、LVPWD、LVESD及LVESV慢性对照组增大，LVEF、LVFS降低(P均<0.05)；慢性模型组LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV较急性肥厚模型组增大，LVEF、LVFS降低(P均<0.05)。见表1。

2.2 左心室质量 UBM所测4组左心室质量均高于精确称重(P均<0.05)，2种方法所测急性模型组左心室质量均低于慢性模型组(P均<0.05)。急性对照组、急性模型组、慢性对照组、慢性模型组UBM所测左心室质量与精确称重均呈正相关(r=0.91、0.79、0.90、0.73，P均<0.05)。见表2。

2.3 心肌组织病理改变 对照组大鼠心肌纹理均清晰，心肌细胞排列整齐，细胞核均匀分布。急性模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，胞浆丰富，细胞核由正常圆形或椭圆形变为长杆状。慢性模型组细胞排列紊乱，心外膜可见炎细胞浸润，心内膜出现心肌细胞坏死迹象及少量成纤维细胞增生。见图2。

3 讨论

目前制作大鼠心肌肥厚模型有以下2种较常见方法[4]，即通过部分结扎主动脉增加后负荷制作压力负荷性心肌肥厚模型，和部分结扎肾动脉制作肾性高血压心肌肥厚模型，具有造模时间短、重复性好等优点，应用较为普遍，但也存在需外科手术干预、术后实验动物死亡率高等问题。近年来激素诱导制作大鼠心肌肥厚模型的方法逐渐被采用。皮下注射ISO可激活肾上腺素受体，增加心肌细胞合成代谢及Ca2+超负荷。ISO作为β受体激动剂，能够提高细胞膜L型钙通道(L-type calcium channel， LCC)介导的Ca2+内流幅度和同步性，通过β肾上腺素受体(β-adrenergic receptor， β-AR)-蛋白激酶A信号通路调控肌质网钙释放通路，最终诱导心肌细胞体积增大、蛋白质合成增加和肌小节重构而导致左心室肥厚[5-6]。ISO诱导大鼠左心室肥厚模型具有制作简单、实验周期短、效果确切等优点。本研究也证实该方法能够使大鼠心肌明显增厚，成功复制心肌肥厚模型。本研究急性模型组大鼠心腔大小无明显变化，心功能亦能维持在正常水平，尚处于急性代偿阶段，病理结果显示心肌细胞出现排列紊乱、细胞核增大等表现；慢性模型组大鼠心脏明显增大，心功能减低，处于失代偿状态，病理示心肌细胞已出现坏死和纤维增生等改变。以上结果提示，急性与慢性心肌肥厚大鼠模型左心室构型和心功能均存在差异。

表1 4组大鼠超声心动图所测左心室形态及功能参数比较(±s)

表1 4组大鼠超声心动图所测左心室形态及功能参数比较(±s)

组别LVAWD(mm)LVPWD(mm)LVEDD(mm)LVESD(mm)LVEDV(ml)LVESV(ml)LVEF(%)LVFS(%)急性对照组(n=10)0.16±0.010.15±0.010.61±0.040.40±0.031.88±0.260.73±0.1361.43±6.9833.80±4.93急性模型组(n=8)0.20±0.01∗0.19±0.02∗0.63±0.030.42±0.052.14±0.200.81±0.2463.90±9.7135.98±6.94慢性对照组(n=9)0.17±0.010.17±0.010.70±0.030.40±0.022.53±0.280.72±0.0971.38±3.6341.88±3.12慢性模型组(n=9)0.21±0.02#0.21±0.02#0.71±0.04Δ0.52±0.04#Δ2.65±0.33Δ1.33±0.26#Δ50.64±6.23#Δ26.73±4.02#ΔF值14.95915.27817.88619.76518.50721.48530.91022.392P值0.0470.0400.0310.0010.0380.0110.0140.026

注：*：与急性对照组比较，P<0.05；#：与慢性对照组比较，P<0.05；Δ：与慢性模型组比较，P<0.05

图2 各组大鼠左心室心肌组织病理图(HE，×100) A.正常对照组心肌纹理清晰，心肌细胞排列整齐，细胞核均匀分布； B.慢性模型组心肌细胞排列紊乱； C.急性模型组心肌细胞排列紊乱，胞浆丰富，细胞核为长杆状

表2 4组大鼠UBM所测左心室质量与精确称重测值比较(±s)

表2 4组大鼠UBM所测左心室质量与精确称重测值比较(±s)

组别左心室质量(g)UBM精确称重t值P值急性对照组(n=10)0.86±0.040.75±0.092.3510.043急性模型组(n=8)1.04±0.03∗0.86±0.09∗2.6220.021慢性对照组(n=9)0.89±0.050.80±0.072.2240.041慢性模型组(n=9)1.22±0.10#Δ0.92±0.08#Δ2.9270.011F值16.78314.491——P值0.0370.042——

注：*：与急性对照组比较，P<0.05；#：与慢性对照组比较，P<0.05；Δ：与慢性模型组比较，P<0.05

利用M型、二维和三维超声心动图均可计算左心室质量。理论上二维和三维方法较M型更准确，但M型超声简单快捷，测量变异性小，准确性较高，多数有关左心室质量与预后关系的研究[7]采用该法。UBM探头频率高达20 MHz，分辨率较普通M型超声显著提高，因而能更加清晰地显示大鼠心脏结构，是无创评价活体大鼠心脏形态学变化的重要手段[8]。本研究中，对于左心室构型正常的对照组，UBM测量左心室质量与金标准左心室解剖称重的相关性良好(r均>0.90)，与文献[9]报道结果相符；但左心室壁增厚、心室重构时，UBM测量左心室质量与真实值的相关性下降，急性及慢性模型组r值分别为0.79和0.73。上述结果提示，虽然M型UBM具有更高的分辨率，但利用M型超声测量左心室质量仍需基于左心室长径为短径2倍的形态学假设，因此，左心室构型发生改变必然对计算结果产生影响。此外，采用M型超声测量左心室径线后，通过公式计算左心室质量时，径线测值需计算3次幂，即使径线误差极小，亦会对左心室质量最终结果产生影响。本研究中UBM对于左心室质量的测值略高于金标准值，与文献[7]报道相符。本组中UBM及体外精确测量均显示急性模型组左心室质量低于慢性模型组，尽管UBM测量与真实值间存在误差，但对于不足1 g的大鼠心脏，UBM技术仍能敏感反映其变化。

总之，ISO所致大鼠急性及慢性心肌肥厚模型左心室形态及功能均发生明显改变；UBM能检出大鼠左心室心肌形态、功能及质量变化，为在模型大鼠体内进行后期生理学、药理学等重要研究提供了可能[10-11]。