低温胁迫对意大利蜜蜂化蛹时差异可变剪接基因的影响

姚 丹,徐新建,周姝婧,周冰峰,朱翔杰

[福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002]

蜜蜂为重要的经济型昆虫，在维护生态系统稳定的同时也为人类带来巨大的经济效益[1].蜜蜂作为典型的社会性昆虫，它的蜂子发育表现出狭温性，低温对蜂子的发育影响很大.意大利蜜蜂Apismelliferaligustica封盖子发育温区为29～38 ℃，蜂群会将蜂巢中心蜂子区域温度恒定在35 ℃来保证蜂子正常发育[2-3].偏离35 ℃，死亡率、发育历期、初生重、外部形态以及成蜂学习记忆能力等都会受到不同程度的影响[4-8]；蜂子发育不正常，将会对蜂群群势及工蜂分工、采集行为产生影响[9].因此，温度成为影响蜜蜂蜂子发育的关键生态因子之一.蜂子不同发育阶段对低温敏感性不同，低温20 ℃下胁迫不同日龄意大利蜜蜂封盖子，表现为化蛹前后对低温最为敏感[10].

可变剪接(alternative splicing,AS)是指mRNA前体通过不同的剪接方式产生不同的mRNA剪接异构体，是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制[11]，同时在调节生长发育，如神经系统和免疫系统发育中起着重要作用[12].目前，通过RNA-seq技术在人和线虫中检测到的基因中含可变剪接基因(alternatively spliced genes,ASG)占95%和71%[13-14]；作为模式生物的黑腹果蝇，检测到约占40%的基因发生AS事件，并且这些AS事件在决定果蝇的性别、神经发育和眼睛发育等发挥着重要作用，且在不同发育阶段AS事件不同[15-16].

化蛹为蜜蜂发育过程的关键阶段，前期研究表明,在蜜蜂变态过程中20 ℃低温对蜜蜂发育影响很大，特别是3日龄封盖子在幼虫向蛹的转变时对温度最为敏感，但其分子机制还不清楚.本研究基于低温(20 ℃)胁迫3日龄意蜂封盖子不同时间的RNA-seq测序数据，进一步对ASG做数量、种类统计和表达谱分析，旨在揭示低温对蜜蜂化蛹影响的分子机制，对丰富蜜蜂生态学和昆虫发育生物学有重要意义.

1 材料与方法

1.1 材料

本研究蜂群分为产卵群和哺育群.将一张空脾调入蜂王产卵力强的蜂群进行限王产卵，工蜂可以自由出入，3 d后将卵脾放入哺育群哺育.移入哺育群5 d后，巢脾上已有封盖的巢房，除去已经封盖的封盖子，计时4 h，将这4 h同时封盖的样本所在巢脾切下，获得4 h以内封盖的封盖子.以上蜂群来自福建福州.

1.2 方法

1.2.1 温度处理 将获得的样本放置在(35±0.2) ℃(RH 75%)CTHI-250B型恒温恒湿箱[施都凯仪器设备(上海)有限公司，精度±0.1 ℃]中培养，3 d后移至低温(20 ℃±0.2 ℃、RH 75%)下分别处理18和36 h(分别设为T18和T36处理组)，没有低温处理为CK.每个处理组和对照组样本各取10只封盖子，3群蜂群的样本作为3个生物学重复，温度处理后立刻置液氮(-80 ℃)中冷冻备用.

1.2.2 ASG 的Veen分析 将保存备用的CK、T18和T36样品进行总RNA的提取，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA后，加入片段化缓冲液使其片断成为短片段的mRNA.以mRNA为模板，委托广州基迪奥生物科技有限公司，采用Illumina HiSeqTM测序平台进行转录组测序，并对测序进行严格的质控，包括过滤下机数据的原始读段、去除含接头的读段、全部都是A碱基的读段、含N比例大于10%的读段和低质量的读段，最终得到有效读段.将统计好的各样本的AS制成文本文档格式导入Omicshare在线工具(http://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/venn)进行ASG分析.

1.2.3 ASG类型分类 采用 rMATS软件[17](http://rnaseq-mats.sourceforge.net/index.html)进行AS事件的分析.以CK与T18、CK与T36、T18与T36比较组的差异ASG为单位，先统计发生的AS事件的种类和数量，再分别计算每类AS事件的表达量，最后对每类AS事件进行差异分析.

1.2.4 ASG的GO分类及KEGG代谢通路富集分析 将筛选出来的共有ASG向基因本体(gene ontology,GO)数据库(http://www.geneontology.org/)的各条目映射，采用映射结果对每一个条目的基因数进行统计，并形成具有某个GO功能的基因列表.KEGG代谢通路富集分析是以整个基因组为背景，共有ASG的KEGG代谢通路为单位，应用超几何检验，找出显著富集的KEGG代谢通路.

2 结果与分析

2.1 ASG的Veen分析

Veen分析结果显示，CK与T18、CK与T36、T18与T36比较组共有的差异ASG数为4 027个，占ASG总数的81.01%，3个比较组特有的ASG数分别为8、19和25个.CK与T18和CK与T36、CK与T18和T18与T36、CK与T36和T18与T36共有的ASG分别为162、285和445个(图1A).

2.2 ASG类型分类

测序结果显示，在CK与T18、CK与T36、T18与T36样本中鉴定出4 971个ASG，产生58 017个AS事件，平均每个ASG上可发生11.67个AS事件.在CK与T18、CK与T36、T18与T36比较组中检测到的AS事件总数分别为17 896、18 432和21 689个，对应的ASG数分别为4 653、4 482和4 782个.在3组所有的AS事件中，有可变3′端剪接(alternative 3′ splice site,A3SS)、可变5′端剪切(alternative 5′ splice site,A5SS)、外显子选择性跳跃(mutually exclusive exon,MXE)、内含子保留(retained intron,RI)和外显子跳跃(skipped exon,SE)等剪接类型，其中以SE、MXE和A3SS等3种剪接类型为主，分别为12 895、3 244和1 502个，占总事件的66.66%、23.44%和16.68%(图1B～1D).

图1 低温胁迫不同时间下ASG的Veen分析及差异类型统计Fig.1 Veen analysis and statistics on ASGs types under different durations of low temperature stress

2.3 低温胁迫不同时间下共有ASG 的GO分类

GO分类结果显示，共有4 027个的ASG分别富集在41条条目上，富集基因数前十的分别为细胞进程(611)、代谢进程(595)、结合(589)、单细胞进程(475)、催化活性(465)、细胞(276)、细胞组件(276)、细胞膜(215)、细胞膜组件(214)和细胞器(186)，同时在应激(134)、发育进程(5)和生长(1)等条目上也富集差异ASG(图2).说明低温胁迫对蜜蜂化蛹时的细胞水平和代谢水平产生较大影响，同时会激发机体产生应激反应.

2.4 低温胁迫不同时间下共有ASG的KEGG代谢通路富集分析

KEGG 代谢通路富集分析显示，4 027个ASG共富集在132条代谢通路上，代谢进程、细胞进程、环境信息进程、遗传信息加工和有机体系统模块分别占89、5、13、21和4条.ASG富集数最多的分别为代谢途径(302)、次生代谢物生物合成(99)、生物合成的抗生素(68)、胞吞作用(57)、微生物在不同环境中代谢(53)、泛素介导的蛋白降解途径(46)、Wnt信号通路(44)、嘌呤代谢(44)、碳代谢(38)和Hippo信号通路(36)等；同时在Top20气泡图(图3)中还包括溶酶体(36)、甘油磷脂代谢(31)、FoxO(28)、神经活性配体—受体相互作用(28)、磷脂酰肌醇信号系统(28)、TGF-beta(21)、谷胱甘肽代谢(19)、背腹轴形成(10)和MAPK信号通路(7)等信号转导及免疫相关等信号通路.说明化蛹时的蜜蜂在受到低温胁迫后，ASG在代谢、生长发育和免疫等方面发挥着复杂和重要的作用.

1：行为；2：生物附着；3：生物调控；4：细胞成分组织或生物合成：5：细胞进程；6：发育进程；7：生长；8：免疫系统进程；9：定位；10：运动；11：代谢进程；12：多组织进程；13：多细胞生物进程；14：生殖；15：生殖进程；16：应激反应；17：信号；18：单细胞进程；19：细胞；20：细胞结合；21：细胞组件；22：细胞外基质；23：胞外区；24：细胞外区域；25：大分子复合物；26：细胞膜；27：细胞膜组件；28：细胞膜内腔；29：细胞器；30：细胞器组件；31：突触；32：突触组件；33：抗氧化活性；34：结合；35：催化活性；36：分子功能调节器；37：分子转换器活性；38：核酸结合转录因子活性；39：信号传感器活性；40：结构分子活性；41：转运子活性.图2 低温胁迫不同时间下共有ASG的GO富集分析Fig.2 GO Enrichment analysis of ASGs under different durations of low temperature stress

图3 低温胁迫不同时间下共有ASG的KEGG代谢通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of ASGs under different durations of low temperature stress

3 讨论

本研究基于对低温最为敏感的3日龄蜜蜂封盖子的RNA-seq深度测序数据，利用生物信息学方法进一步对低温胁迫后的差异ASG进行分析.结果显示，低温胁迫3日龄蜜蜂封盖子后有4 971个差异ASG响应低温，且有4 027个差异ASG为在低温胁迫不同时间所共有，表明低温胁迫后这部分ASG在维持机体正常生命活动等方面发挥着重要作用；同时，差异ASG数量随着低温胁迫时间的延长而增多，表明更多的差异ASG参与蜜蜂机体的低温胁迫应答.

蜜蜂个体在应对低温时，ASG可能在物质代谢方面发挥着重要作用.低温胁迫化蛹期封盖子对碳代谢、氨基酸代谢、蛋白质合成与分解产生较大影响.ASG富集与代谢进程相关的信号通路占67.42%，这些代谢通路主要包括与氨基酸代谢相关的丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、酪氨酸代谢等信号通路；与蛋白质相关的蛋白质出口、内质网中的蛋白质加工等信号通路；与碳代谢相关的甘油磷脂代谢、糖胺聚糖降解和甘油酯代谢等信号通路.糖类物质、脂类物质和蛋白质是机体为了维持生命活动的主要供能物质[18-20]，推测3日龄封盖子的基础物质代谢合成与分解在低温胁迫时受到影响.

ASG在化蛹期蜜蜂的发育中起重要作用，同时可能对免疫系统(细胞免疫和体液免疫)产生影响.研究表明，温度会影响黄粉虫的免疫防御能力[21]；果蝇和小胸鳖甲在低温胁迫后与免疫系统相关的多个基因差异表达[22-23].本研究中，共有的差异ASG分别富集在生物学进程(47.27%)、分子功能(26.59%)和细胞过程(26.25%)3个部分(41个GO条目)；同时，共有的ASG与细胞免疫相关的信号通路，包括胞吞作用(57)、泛素介导的蛋白水解(46)和溶酶体(36)等信号通路极显著富集(P<0.01)，与体液免疫，包括Wnt(44)、Hipoo(36)、FoxO(28)、磷脂酰肌醇(28)、TGF-beta(21)和Hedgehog(15)等信号通路显著富集(P<0.05).因此，推测在封盖子应对低温时，ASG对化蛹期蜜蜂的生长发育起着重要作用，同时对免疫系统产生影响.

低温胁迫3日龄封盖子无法化蛹的原因，可能是蜕皮激素(20E)初级应答基因Br-c(GenBank登陆号:552255)受到低温胁迫后，AS类型发生变化，使得蜕皮信号传递受阻.3日龄封盖子为幼虫到蛹的关键时期，在此过程中，20E发挥着重要的调控作用[24].Br-c基因是20E的初级应答关键基因之一，如果该基因的表达受到抑制或其他干扰，20E参与的信号传递将会受到影响[25-26].当20E与细胞内受体复合物EcR/USP结合后，激活初级应答基因，初级应答基因再激活次级应答基因表达，继而由次级应答因子调控生长发育[27-28].本研究的AS数据显示，Br-c基因存在于背腹轴形成的信号通路上，Br-c基因在受到低温胁迫后出现A3SS、MXE、RI和SE等4种剪接类型.多种的剪接类型直接导致产生不同的mRNA剪接异构体，可能使Br-c基因表达产物的结构和功能发生改变，推测可能是初级应答基因无法将信号传递给次级应答因子，从而无法调控生长发育.

3日龄封盖子在受到低温胁迫后恢复正常温度培养，化蛹率随着低温胁迫时间的延长而下降，推测可能是由于ROS1基因(GenBank登陆号:410671)在受到低温胁迫后AS类型发生改变导致这一现象.本研究发现，3日龄封盖子受到低温胁迫时虫体处于滞后发育状态，恢复正常温度后T18处理组的化蛹率显著高于T36处理组.通过对共有的ASG进行KEGG代谢通路富集分析，检测到ROS1基因富集在MAPK信号通路上.MAPK信号通路在细胞的增殖和分化过程中发挥着重要作用，此通路上的生长因子与受体结合激活ROS1(RTKs)基因后，将信号传递给Ras基因来激活Raf基因，活化后的Raf基因来促进ERK基因磷酸化及激活AP-1基因、SAP基因等涉及增殖反应的转录分子，促进细胞增殖[29-30].本研究中，T18处理组的ROS1基因发生的可变类型为A3SS、A5SS和SE，而T36处理组的ROS1基因发生的可变类型为MEX、A3SS、A5SS和SE，多出一种MEX的AS类型，这一基因AS类型的增多，可能直接影响到基因的功能及表达量的改变，这可能是T18和T36处理组蜜蜂恢复正常温度培养，化蛹率出现差异的关键原因.