基于磷酸酶法研制的微囊藻毒素自动检测仪

2020-04-01

分析仪器 2020年1期

(杭州绿洁环境科技股份有限公司，杭州 310015)

微囊藻毒素(microcystins，MC) 是一类具有生物活性的环状七肽毒素物质，可由铜绿微囊藻、鱼腥藻、束丝藻、念珠藻等产生，现已发现有90多种MC异构体[1]。由于其对肝脏、肾脏等器官毒性以及强促癌性，微囊藻毒素已被认为是严重威胁野生动植物以及人类健康的环境污染物，并得到广泛关注[2]。国家标准GB/T5749-2006《生活饮用水卫生标准》中规定的MC-LR最大残留限量为1.0 μg /L[3]。

目前检测MC的研究方法主要有生物毒理检测法、化学分析法、以及生物化学分析方法等[4]。生物毒理检测法主要包括动物毒性法和细胞毒性法[5]；化学分析法有高效液相色谱(HPLC)法[6]、气相色谱(GC)法[7]、薄层层析色谱(TLC)法[8]、毛细管电泳(CE)法[9]和液相色谱-质谱联用(LC-MS)法[10]等；生物化学分析法包括酶联免疫吸附(ELISA)法[11]和蛋白磷酸酶抑制(PPIA)法[12-15]；分子生物学法即PCR检测法[16]。其中HPLC-MC联用是定量检测和分析MC的经典可靠技术，检测限在ng级，但MC标样的缺乏使该法的应用受到限制，而且其所需设备昂贵，检测成本高，对操作人员的专业技术要求高。以生物学为基础的PPIA、PCR等技术检测精度高，但要大规模的应用尚需在稳定性的保持、操作的简便和经济性等方面加强和提高。ELISA 商品试剂盒对样品前处理要求低、操作简单、检测灵敏度和选择性高，但是交叉反应变化比较大，且能检测的MC 的种类较少。因此使水环境中MC 的分析和检测更加经济、方便、快速和准确，并实现水中MC的连续和自动检测分析是研究的重点。

为开发一种利用生物法检测水中微囊藻毒素的自动检测仪，经过调研发现磷酸酶法具有检测过程简单，检测成本低，灵敏度高等优点。因此选用磷酸酶法作为自动检测仪分析方法，对样品中的微囊藻毒素含量进行分析。首先在实验室酶标仪上验证该方法的可行性。根据实验室验证结果及检测流程设计芯片及各个模块，并测试芯片及模块功能。最后进行仪器整机安装调试、运行测试及实际站点试用。

采用多通道微流芯片微管路定量、微量注射泵定量避免各种试剂的交叉污染。三维运动机械臂进行各位点定位及试剂加样。设置清洗模块对各试剂管路及进样针进行清洗，恒温模块提供酶反应所需要的温度条件，设置光电检测模块对酶底物显色反应产物进行405nm处吸光度检测，通过吸光度大小对微囊藻毒素含量进行定量。将各模块进行组合，并用安卓系统进行控制，得到一种高效、快速、自动检测水中微囊藻毒素的检测仪，仪器开发流程图如图1所示。

图1 仪器开发流程图

1 检测原理

基于微囊藻毒素对磷酸酶活性具有强烈的抑制效应的特点，通过对磷酸酶活性的测定得到微囊藻毒素对磷酸酶活性的抑制程度，抑制程度大小与微囊藻毒素浓度呈正相关性，进而对样品中的微囊藻毒素含量进行分析。

2 检测流程

仪器检测流程如图2所示，测试开始后首先于反应模块中加入水样、磷酸酶溶液、显色底物。37℃条件下，三者混合后水样中的微囊藻毒素会导致部分磷酸酶失活，而仍具有生物活性的磷酸酶会作用于显色底物发生显色反应。显色反应结束后，加入酸终止显色反应，并在405nm处检测显色产物吸光度，微囊藻毒素含量与显色产物吸光度大小成反比。检测完成后纯净水清洗管路、进样针管、反应模块、检测模块等。

图2 微囊藻毒素自动检测仪检测流程

3 仪器设计

根据以上检测流程需求设计微囊藻毒素自动检测仪的各功能模块，仪器整体设计图如图3所示，主要部件包括进样系统(主要包括定量芯片、机械臂、微量注射泵等部件)、清洗站、反应(温控)模块、检测(比色)模块、控制系统5大模块。

图3 微囊藻毒素自动检测仪设计图

3.1 进样系统

进样系统是一个由定量芯片、机械臂、微量注射泵、蠕动泵、试剂存放区、气泵和进样管道组成的完整的采样系统，试剂管路由防腐蚀的材料构成，不会因试剂或实际水样的腐蚀而影响测定结果。利用三维运动机械臂进行各个位点精确定位及试剂加样，保证试剂被添加到反应模块。

3.1.1定量芯片

采用微流芯片中微米级管道进行单独定量添加各种测试剂，定量准确且避免交叉污染。

(1)芯片设计

微流芯片包括3条定量通道，分别为70μL流磷酸酶试剂通道、90μL显色底物通道、70μL终止液通道。通道上部设有试剂溢流口及气泵进气口，下部设有试剂进口、试剂出口，利用三通阀控制进口、出口开关。利用蠕动泵将试剂泵入芯片，通过控制蠕动泵转速及转动时间保证试剂充满芯片通道，多余试剂溢流回试剂瓶。利用气泵将芯片通道中试剂吹入各反应模块。通过节流阀门调节控制气流大小，三通阀控制气泵进气口的开关，通过控制气泵工作时间保证将试剂全部排出芯片通道，芯片三维效果图如下图4所示

图4 微流定量芯片三维图

(2)芯片制作

芯片制作包括芯片基片的加工制作、基片与盖片之间的键合。芯片采用PMMA材料。根据设计图纸进行备料，上机台CNC编程进行芯片基片的加工。加工结束后需去除通道表面及基片表面的毛刺，先用2000号砂纸进行粗抛光，然后用布轮将抛光液进行精抛光，保证芯片表面的平行度及芯片内部通道的光滑度，防止通道堵塞情况出现。

采用热压键合方法对芯片基片及盖片进行键合。首先检测键合设备状态是否正常，在两加热板之间放入预键合的基片及盖片，两者对齐并放置好，芯片上下面放置抛光的钢化玻璃，防止芯片因热变形导致表面不平，放置好后关闭舱门。抽真空至真空度到-0.1MPa 后开始对芯片进行加压操作。调节调压阀钮，待芯片键合舱内的压力指数达到2.0MPa后停止加压力。调节调温旋钮到所需的键合温度，对芯片加热直至95℃，键合时间为180s。键合完毕后取出芯片进行测试，检测通道是否有堵塞、漏气、通道体积定量不准等问题。

3.1.2微量注射泵

由于实际水样中可能含有颗粒物质，聚集或者沉淀容易堵塞微流管道及其进出口。所以选用最大体积为1mL微量注射泵进行实际废水样品进样，防止管道堵塞情况发生。由步进电机控制注射泵活塞，通过步进电机步数控制注射泵抽取试剂体积，最大步数为2000步(1mL)，最小步数为1步。

3.1.3机械臂

选用越疆DOBOT机械臂，该机械臂具有X-Y-Z三维运动功能，重复定位精度为0.2 mm。TTL接口并行方式传输数据，由驱动板主控电路板上输出的TTL数据信号经电缆线直接传送到控制系统面板的输入接口，通过控制系统对机械臂进行控制。

所有试剂管路出口端穿过不锈钢空心针管，将针管固定于机械臂爪子上，其中芯片定量试剂针管出口端高度高于微量注射泵定量试剂针管出口端。利用机械臂两点定位法定位不同的点位，例如水样位、反应位、检测位、清洗位等，机械臂到不同的位点进行试剂抽取或者试剂添加动作。

3.2 清洗站

仪器设置有清洗站，主要用于抽取试剂的针管、试剂管路、反应模块、检测模块的清洗，防止不同样品、试剂之间的交叉污染。利用蠕动泵提供动力抽取纯净水至清洗站，清洗站为带有底座的双层空心圆柱体，纯净水从底部进入内层腔体，废液及溢流液体从外层环形腔体体排出至废液瓶。

3.3 反应模块

反应部分是指恒温水浴酶反应显色模块。内置加热棒进行加热，PT100温度传感器进行温度检测。反应腔内加水加热至37℃，后插入试管，反应模块实物图如下图5所示。显色反应在试管内进行。

图5 反应模块实物图

3.4 检测模块

检测位用于显色终止后显色产物吸光度的检测。内置光源、微量比色皿、光电池等部件，组合成为一个405nm处吸光度检测器。测定值输出信号应稳定，每次检测样品前进行空白样检测，扣除背景干扰，以保证测量数据的准确性。

3.5 控制系统

3.5.1控制系统设计

控制部分包括系统控制硬件和软件，系统控制硬件采用安卓Y7P10触摸屏系统，具有数据采集、处理、显示存储和数据输出等功能；具有故障信息反馈功能；带有RS485和RS232接口，符合HJ/T 212标准具有模拟量和数字量输出接口，通过数字量接口可接收远程控制指令；符合HJ 477标准数据处理系统应存储至少12个月的原始数据，可以设置条件查询和显示历史数据。将检测流程编译为脚本语言，并将脚本文件导入至安卓系统，仪器各组件和模块按照脚本语言指令执行测试功能。

3.5.2电路系统设计

微囊藻毒素自动检测仪电路设计主要为了实现仪器各模块电子元器件(三通阀、蠕动泵等)的控制，对各功能模块进行连接。详细的电路设计图分为主电路设计、单片机电路设计、通讯电路、电机控制电路、光度计模拟信号采集电路、电源电路、开关控制电路、大功率开关控制电路和温度读取电路等。

其中主电路主要对各个功能模块电路以及各电路之间的连接关系设计。电路主图设计如图6所示。