MR扩散峰度成像对非酒精性脂肪性肝病诊断价值

贾宏茹 李畅 刘畅 彭云 傅剑雄 凌俊 孙骏 叶靖 罗先富

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）目前已成为主要的慢性肝病，且患病率呈逐年上升趋势［1,2］。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）为疾病的进展形式。早期诊断NASH并通过早期干预可使疾病进展停止甚至逆转［3,4］。经皮肝穿刺活检是诊断NASH的金标准。但其具有取样误差，且具有侵袭性、出血、感染等严重并发症风险而不利于临床推广。磁共振扩散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI）是一种反应活体生物组织内水分子运动情况的成像方法［5］。研究表明单指数模型表观扩散系数（apparent diffusion coefficient，ADC）与肝脏脂肪分数呈负相关，但不能反应炎细胞浸润程度。单指数模型假设机体内水分子运动呈高斯分布，而体内由于生物膜、大分子物质、血流灌注等因素水分子呈非高斯分布，所以单指数模型参数反映的组织病理学信息有限。扩散峰度成像（diffusion kurtosis imaging，DKI）假设机体内水分子运动呈非高斯分布［6,7］，研究表明，相较于单指数模型，DKI对肝纤维化和肝肿瘤的诊断具有更高的价值［8,9］。目前，国内外对 DKI在NAFLD分级诊断及早期诊断NASH中的应用价值报道甚少。本文假设DKI对肝脏脂肪变性、炎症、肝细胞气球样变和纤维化更加敏感，可以用于NAFLD的分级诊断并早期诊断NASH。为此通过高脂肪喂养构建NAFLD动物模型，探讨DKI成像对其诊断价值。

资料与方法

1.动物模型

本研究经本院伦理委员会及实验动物管理委员会批准。32只雄性新西兰大白兔，平均体重约2.5 kg，随机分为正常组（n=6）和高脂肪组（n=26）。所有兔子置于独立笼子中，室温（21±2）℃。昼夜循环为12 h，每天每只兔子的饲料限制为100 g。正常饲养组（n=6）标准饲料喂养3周。据文献报道高脂饲料喂养兔子8周可成功获取NASH动物模型［10,11］，所以本研究把高脂饲料喂养时间选定为1、3、4、8周。高脂饲喂养1周组、高脂饲料喂养3周组、高脂饲料喂养4周组、高脂饲料喂养8周组， 分别为 6、6、6、8只， 以达到不同程度的NAFLD，包括单纯脂肪变性（1周）到 NASH（8周）［12］。高脂饲料配比为标准饲料+2%胆固醇+10%甘油三脂，由南通特洛菲饲料科技有限公司提供。

2.磁共振成像

采用3.0 T磁共振（GE Discovery 750 W）进行扫描。所有实验兔采用3%戊巴比妥钠1 ml/kg进行麻醉后扫描。采用16通道关节表面柔线圈（GE Flex），采用轴向单次回波平面自由呼吸下进行肝脏DKI和 DWI扫描［13,14］。扫描参数如下：TR 2500 ms，TE 77.4 ms，矩阵 128×128，层数 9，层厚 3.0 mm，层间距0.3 mm，视野15.0 cm×10.0 cm。为获得高信噪比图像，采用 3个 b值分别为 0、400、800 s/mm2，每个b值采用15个扩散梯度场。采集时间为 2 min 38 s。DWI序列扫描参数为：TR 2500 ms，TE 77.4 ms，矩阵 128×128，层数 9，层厚3.0 mm，视野15.0 cm×10.0 cm。采用2个b值分别为 0、600 s/mm2。

3.图像分析

将扫描图像导入后处理工作站ADW 4.6，数据测量由2名医师独立完成。选取呼吸运动伪影较小3个层面，每个层面放置一个兴趣区（ROI），每个ROI大小约30～50 mm2，分别测量单指数模型参数（ADC值）、扩散峰度成像模型参数（FA值、MD值、MK值），最后6个ROI的均数用于统计分析。为保证测量数据的准确性，每个ROI尽量避开肝脏大血管、肝内胆管区域、肝脏边缘。ADC为表观扩散系数，代表扩散运动的自由度，表示单位时间内水分子随机扩散运动的范围，单位为mm2/s。ADC值计算公式如下：

注：其中S（b）为相应b值扩散梯度场下的信号强度，S（0）为扩散梯度场为0时的信号强度。

FA值、MD值和MK值通过DKI模型参数获取，DKI模型公式如下：

其中MK为一无量纲参数，MK是公式内k值平均值，用来评估真实水分子扩散位移偏离高斯分布的程度，其大小取决于生物体内组织结构的复杂程度，既体素内组织结构越复杂，水分子扩散偏离高斯分布程度越大，MK值越大。扩散系数MD是公式内D值平均值，MD值为经非高斯分布矫正后的ADC值，单位为mm2/s，表示单位时间内水分子扩散运动的距离，反应组织内水分子的整体扩散水平和扩散阻力。

4.组织病理学分析

所有兔子MR扫描后处死，收集所有肝脏组织标本，用10%甲醛液固定，脱水、石蜡包埋、切片，进行常规HE染色和马松三色染色（Masson），所有组织病理切片由一名具有15年肝脏病理工作经验的医师独立完成，然后再回溯分组。根据美国国立卫生研究院NAFLD活动度评分系统（NAFLD activity score system，NAS）， 对肝脏进行NAS 等级评分（0～8 分）：肝脏脂肪变性（0～3 分），小叶炎症（0～3 分），肝细胞气球样变性（0～2 分），各项评分整合，0 分诊断为正常（Normal），1、2 分诊断为单纯性脂肪肝（SS），3、4分诊断为临界性脂肪性肝炎（Borderline），大于等于 5分诊断为NASH。根据肝脏METAVIR纤维化评分系统，Ⅰ级F0表示无纤维化；Ⅱ级F1表示窦周纤维化；Ⅲ级F2表示门管区纤维化；Ⅳ级F3级表示广泛桥接纤维化；Ⅴ级F4表示肝硬化。

5.统计学分析

所有数据采用SPSS软件包和MedCalc软件包进行分析。采用组内相关系数（intraclasscor relation coefficient，ICC）检验2名医师扩散参数数据测量结果的一致性。采用Shapiro-Wilk检验评估计量资料是否符合正态分布，正态分布资料以平均数±标准差表示。NAFLD各组间磁共振参数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-T检验。采用Spearman相关性分析评估各扩散参数与NAFLD不同等级的相关性。采用多因素逐步回归分析明确各扩散参数变量的独立影响因素（脂肪含量、肝细胞气球样变、炎细胞浸润、METAVIR纤维化）。在单变量分析中，P<0.10的变量被纳入回归模型。采用受试者工作面积特征曲线（ROC）分析评估各扩散参数（ADC、MD、MK）诊断不同等级NAFLD的效能，由最大优登指数确定截断阈值。采用比较ROC评估单指数模型参数ADC值及扩散峰度成像参数MD值和MK值诊断NASH的效能。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.组织病理学

高脂肪/胆固醇饮食的兔肝标本显示，可见不同程度大泡性脂肪空泡、小滴性脂滴空泡、肝细胞气球样变性及炎细胞浸润，这些病理变化与高脂饮食的持续时间有关（图1）。本研究高脂饮食组的实验兔子1只为正常组，余均发展为NAFLD（25/26）。根据NAS评分系统，新西兰大白兔不同等级NAFLD动物模型分布情况见表1。根据METAVIR评分系统，最终肝纤维诊断为为Ⅰ级为20只、Ⅱ级为11只、Ⅲ级为1只，本实验研究没有Ⅳ级和Ⅴ级实验兔子。

图1 a)正常对照组肝脏组织病理切片，正常肝小叶结构存在，肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状排列，肝窦结构清晰（HE×400）；b)单纯性脂肪肝组、c)临界组及d)NASH组兔子肝脏组织病理切片，实验组肝细胞内出现不同程度脂肪堆积，可见大泡性脂肪空泡、小滴性脂滴空泡、肝细胞气球样变性及炎细胞浸润，正常肝小叶结构消失，肝细胞索排列紊乱，肝窦变窄（HE×400）

表1 NAS评分系统不同等级NAFLD兔模型分布情况

表2 不同等级NAFLD的磁共振扩散参数 (ADC、FA、MD、MK)

图2 正常组磁共振扩散参数轴位图。a)正常组DWI图（b=0 s/mm2）；b)～e)分别为正常组 ADC、FA、MD 和 MK 的伪彩色图，其值 分别 为 1.360 ×10-3mm2/s、60.4%、2.313 ×10-3mm2/s和 0.999图3 NASH组磁共振扩散参数轴位图。a)NASH组DWI图（b=0 s/mm2）；b)～e)分别为 NASH 组的 ADC、FA、MD 和 MK 伪彩色图，其值分别为 0.847×10-3mm2/s、69.2%、1.197×10-3mm2/s和 1.392

2.扩散定量参数测定

两位医师测定的各磁共振参数 ADC、FA、MD、MK组内变异系数 ICC分别为 0.897、0.885、0.969、0.927。正常对照组、单纯性脂肪肝组、临界组及NASH组各磁共振多b值扩散模型参数平均值见表2。MD值在正常组和单纯性脂肪肝组、单纯性脂肪肝组和临界组、临界组和NASH组间有统计学意义（P均＜0.05）；MK值在临界组和NASH组间有统计学差异，但在正常组和单纯脂肪肝组、单纯脂肪肝组和临界组之间无显著性差异。

3.磁共振扩散参数与NAFLD不同等级的关系

单指数模型参数ADC值和DKI模型参数MD值与NAFLD等级程度呈负相关，相关系数分别为：-0.529、-0.905（P 均＜0.05）；DKI模型参数 MK值与NAFLD等级程度呈正相关，相关系数为0.761（P均＜0.05）；FA 与 NAFLD 等级程度无显著相关性（P=0.869）（表 2）。各磁共振扩散参数（ADC、FA、MD、MK）在正常组和 NASH 组的伪彩图见图 2、3。

多因素逐步回归分析结果显示，在肝脏脂肪含量、肝细胞气球样变性、炎细胞浸润和纤维化评分中，脂肪含量是决定DKI模型参数MD值的独立影响因素（R2-adjusted=0.711；P＜0.001）；肝细胞气球样变是决定单指数模型参数ADC值、DKI模型参数MK值的独立影响因素（ADC：R2-adjusted=0.275；MK：R2-adjusted=0.496；P＜0.001）。

4.ROC曲线分析

单指数和DKI模型参数诊断NASH的ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）、敏感度、特异度和截断阈值见表3。

图4 磁共振参数对NASH的诊断的ROC曲线。MD及MK的诊断效能优于ADC值

表3 扩散定量参数在诊断NASH的诊断效能

比较 ROC显示，DKI模型参数 MD值（AUC为 0.955）和 DKI模型参数 MK值（AUC为 0.905）对NASH的诊断效能均优于单指数模型参数ADC值 （AUC 为 0.727）（P＜0.05）。 MD 与 MK 在区分NASH与非NASH方面无显著差异（图4）。

讨 论

本动物实验研究初步表明，DKI可用于NAFLD的分级诊断。MK值和MD值与疾病等级具有较高相关性。DKI模型参数MD值、MK值对NASH的早期诊断效能均优于单指数模型参数ADC值。与传统DWI相比，DKI能更精确的反映和量化生物组织体内水分子扩散的非高斯分布特征和组织结构的复杂性。

平均扩散系数MD反映水分子在多个方向上的平均扩散。以往研究表明，MD值比ADC值具有更准确的诊断效能［13,15］。同样，研究也表明，单指数模型参数ADC值、DKI模型参数MD值与非酒精性脂肪性肝病NAS活动度等级评分呈负相关，相关系数分别为-0.529、-0.905（P＜0.05）；且 MD值在肝纤维化不同等级评分的诊断中相较于ADC值显示出更高诊断效能。随着疾病进展，肝脏内脂肪堆积、肝细胞气球样变性、炎细胞浸润、肝窦及门脉周围纤维组织增生等均可导致肝脏组织结构复杂性增高，水分子非高斯分布特征越明显［16,17］。DKI以非高斯分布理论为基础，DKI对组织微结构更加敏感，相较于单指数ADC模型，在高b值下能更好的拟合水分子非高斯分布行为，更有利于病变的早期发现［18,19］。

MK值反应组织生物复杂性［20］。Anderson等［21］和 Hu 等［22］研究显 示，MK 值与 NAFLD 活 动度等级评分呈正相关。本研究表明，MK值与NAFLD活动度等级评分呈正相关，通过多因素逐步回归分析显示肝细胞气球样变性是MK值的独立影响因素，而与肝脏脂肪变性、小叶炎症和纤维化无关。Yang等［23］报道表明，在这些因素中，纤维化是肝纤维化中唯一与MK相关的变量，但本研究结果表明，纤维化不是MK的独立影响因素，其可能原因是本研究动物模型中纤维化等级不高，以Ⅰ级、Ⅱ级为主，且缺乏高级别肝纤维化。而本研究目的是在发展为肝纤维化之前发现早期发现NASH，NAFLD疾病进展过程中脂肪变性、炎症、坏死、肝细胞气球样变和肝细胞再生的存在改变了组织的微观结构，导致MK值增大。

Joo等［24］研究报道正常组 ADC值较 NAFLD组低，但在NAFLD各组间无统计学差异（ρ=-0.27；P=0.17）。本研究显示，ADC值与NAFLD等级评分呈负相关，相关系数为-0.529（P=0.002），但 ADC值在临界组和NASH组无统计学差异。Joo等［24］通过双指数模型对NAFLD分级诊断发现，双指数模型参数f与NAFLD等级程度呈负相关，能早期诊断NASH。而Guiu等［25］研究表明，与健康人群相比，脂肪肝患者的f升高。因此，双指数模型在NAFLD分级诊断中的准确性有待进一步验证。磁共振对比增强扫描可能评估NAFLD的炎性活动，然而，这会增加磁共振成像检查的成本和复杂性、可能的过敏反应和肾损伤。

本研究尚存以下不足：（1）本研究为动物实验，病理学改变与人体疾病进展存在差异。（2）本研究所选取的动物样本量小，磁共振数据采集是在自由呼吸的情况下，影响了图像质量。

综上所述，本研究证明DKI在动物模型中对NAFLD分级的可行性。DKI模型参数MD值和MK值均能有效对NASH的鉴别和检出，且优于传统DWI模型参数ADC值，因此，DKI更加精确反映NAFLD等级评分的组织病理学改变。