不同熬煮时间对台湾泥鳅汤蛋白组分及抗氧化能力的影响

(温州科技职业学院,浙江温州 325006)

台湾泥鳅(Paramisgumusdabryanusssp.)是台湾地区选育的泥鳅新品种,肉鲜味美,富含优质蛋白质、脂肪酸、多种矿物元素及B族维生素[1]。中医认为,泥鳅具有补中气、祛湿邪之用[2],被称为“水中人参”,具有较高的药用价值。现有研究表明,从泥鳅中提取的蛋白、多糖、氨基酸等,具有提高机体免疫力、抗炎、抗氧化等作用[3-6]。

汤在中国人的饮食中居于十分重要的地位,古代哲人对汤膳的评价“宁可食无馔,不可饭无汤”就说明了汤膳的重要性[7]。汤的烹饪方式有利于营养物质的输送,较大程度地保留食材风味的同时,可使食材中的营养物质最大程度地溶出促进消化,具有补充能量、滋补养生等功效[8]。不同的熬煮时间对汤的营养价值会有不同的影响,倪东东等[9]发现,采用传统常压熬煮大鲵汤,熬煮60 min时汤中脂肪含量适宜,且饱和脂肪酸/多不饱和脂肪酸值(SFA/PUFA)最佳,氨基酸含量最高;朱琳等[10]研究发现,当乌鱼汤在熬制1.5 h后,营养物质的含量明显提高,熬制鱼汤的时间应控制在1.5～3 h。

泥鳅汤是一道历史悠久的家常菜,其食疗和药用价值早已被报道[11],但大部分集中在临床医学研究上,而关于泥鳅汤的营养成分种类及其含量、泥鳅汤的抗氧化性研究鲜见报道。

本实验以台湾泥鳅为原料,通过分析泥鳅汤的可溶性蛋白、游离氨基酸、蛋白质组分变化及ABTS+·、DPPH·清除率,探究了泥鳅汤熬煮过程中营养品质的变化规律及抗氧化能力的变化,旨为科学合理地烹饪台湾泥鳅汤提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜活台湾泥鳅 浙江平阳美飞淡水泥鳅养殖专业合作社;食盐、姜等 永辉超市;乙腈 色谱纯,北京坛墨质检科技有限公司;正己烷 HPLC级,北京坛墨质检科技有限公司;十七种氨基酸标准品 中国药品生物制品检定所;蛋白Marker 10～200 kDa,福州飞净生物科技有限公司;牛血清白蛋白、乙醇、SDS、尿素、巯基乙醇等 均为国产分析纯。

Agilent1100液相色谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司;Agilent ZORBAX Eclipse AAA 安捷伦科技(中国)有限公司;伯乐Mini-PROTEAN Tetra cell165-8001电泳槽 美国Bio-Rad公司;721G紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;ALPHA2-4/LSC真空冷冻干燥机 德国Christ公司。

1.2 实验方法

1.2.1 台湾泥鳅汤加工工艺 台湾泥鳅→宰杀→放血→去黏液、内脏→清洗→分割、称质量→加水→大火煮开→小火慢炖→台湾泥鳅汤

1.2.2 不同熬煮时间对台湾泥鳅汤品质的影响 分别以30、60、90、120、150 min为熬煮时间熬制泥鳅汤,取100 mL泥鳅汤样品,于4 ℃、15000 r/min下离心10 min,取上清液进行蛋白组分(可溶性蛋白质、蛋白质电泳及游离氨基酸组成)分析和ABTS+·、DPPH·清除率的测定。

1.2.3 可溶性蛋白质含量的测定 采用双缩脲法测定泥鳅汤中可溶性蛋白质含量[12]。准确移取上清液1 mL于试管中,加入4 mL双缩脲试剂,充分振荡均匀,置于室温下反应30 min。然后,将试样置于比色皿中用分光光度计在540 nm波长处测定吸光度。

1.2.4 游离氨基酸含量的测定 取上清液(1.2.2)2 mL于离心管中,加入2 mL 0.02 mol/L盐酸,10000 r/min离心10 min,取上清液定容至10 mL用0.45 μm滤膜过滤,移取5 μL滤液采用安捷伦公司自动在线衍生化方法,一级氨基酸与邻苯二甲醛、二级氨基酸与芴甲氧羰酰氯衍生后,采用高效液相色谱测定样品[13]。色谱条件:色谱柱为ZORBAX Eclipse AAA(4.6×150 mm,3.5 μm);紫外检测波长为338 nm,荧光检测信号为(激发波长266 nm,发射波长305 nm);流动相A为40 mmol/L磷酸二氢钠(pH7.8);流动相B为乙腈/甲醇/水=45/45/10;流速为1 mL/min;洗脱程序:0～31 min,0% B;31～33 min,54% B;33～41 min,100% B;41～43 min,0% B;流速为1 mL/min。取17种标准氨基酸混合样品,每种最终浓度为0.25 μmol/mL,在同样条件下进样,将得到的每种氨基酸的峰面积对浓度作图绘制17种氨基酸标准曲线,采用峰面积外标法进行定量。

1.2.5 SDS-PAGE蛋白电泳 取一定量的上清液(1.2.2)于真空冷冻干燥(绝对压力85 Pa,升华温度20 ℃)下干燥32 h,干燥所得样品用蒸馏水稀释10倍,添加等体积处理液(2% SDS、8 mol/L尿素、2%巯基乙醇)匀浆后100 ℃加热5 min,室温下在10000 r/min下离心15 min,上清液为上样样品。采用5%浓缩胶和12%分离胶,上样量为10 μL。在稳压稳流电泳仪上进行电泳,调节电流,浓缩胶中为15 mA,分离胶为20 mA。当溴酚蓝指示剂到达凝胶底部时停止电泳[14]。

1.2.6 抗氧化能力的测定

1.2.6.1 DPPH·清除率测定 参照文献[15]中的方法并略做改进。取1 mL上清液(1.2.2)加1 mL浓度为0.2 mmol/L的DPPH,室温下静置30 min后,在517 nm波长处测吸光度变化。

DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai为1 mL的DPPH+l mL样品的吸光度;Aj为1 mL溶剂+1 mL样品的吸光度;A0为1 mL DPPH+1 mL溶剂的吸光度。

1.2.6.2 ABTS+·清除率的测定 参照胥莉等[16]的方法并稍作修改。将7 mmol/L的ABTS溶液10 mL和7.35 mmol/L的K2S2O8溶液5 mL混合后,在室温下避光放置12～16 h,形成ABTS储备液,使用前用无水乙醇稀释成ABTS工作液,使其在734 nm波长处的吸光度为0.70±0.02。吸取50 μL上清液(1.2.2)与ABTS工作液3 mL混合均匀,室温反应10 min后,于734 nm波长处测定其吸光度(A样品),空白组以水代替样品(A空白)。按下式计算ABTS+·清除率:

ABTS+·清除率(%)=(1-A样品/A空白)×100

1.3 数据处理

数据处理采用Excel软件进行初步分析,并用Origin 8.5软件作图,采用SPSS 22.0软件进行相关处理和分析,其中,显著性分析采用t-检验,P>0.05说明无显著性差异,P<0.05说明差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同熬煮时间对泥鳅汤可溶性蛋白含量的影响

熬煮过程中部分可溶性蛋白质会溶于汤汁,且汤汁中的可溶性蛋白与肉汤的感官品质具有正相关关系[17]。图1为不同熬煮时间对泥鳅汤的可溶性蛋白含量的影响。由图1可知,在熬煮过程中,熬煮30～150 min,汤中可溶性蛋白质含量显著(P<0.05)上升,在30～90 min期间上升速率较为相近,在90 min后上升速率有所提高,到150 min时可溶性蛋白质含量达到18.49 mg/mL。这与倪冬冬等[9]研究大鲵汤加工过程中蛋白质溶出趋势一致。

图1 不同熬煮时间对泥鳅汤的可溶性蛋白含量的影响Fig.1 Effect of different boiling time on soluble protein content of loach soup注:不同小写表示差异显著(P<0.05);图3同。

2.2 不同熬煮时间对泥鳅汤蛋白组分的影响

不同熬煮时间泥鳅汤蛋白SDS-PAGE电泳图如图2所示。由图2可知,随着熬煮时间的延长,分子量>100 kDa蛋白条带逐渐变浅,分子量为63～100 kDa的蛋白条带逐渐增多和加深,说明大分子蛋白在熬煮过程中发生降解,随着熬煮时间的延长,蛋白质降解程度不断加深。在汤的熬煮过程中,肌肉纤维束开始破裂,肌肉纤维中的蛋白质在热的作用下开始降解,水解成不同大小的短肽以及相应的游离氨基酸[18]。

表1 台湾泥鳅汤的游离氨基酸含量Tabla 1 Free amino acids contents of in loach soup

图2 不同熬煮时间泥鳅汤的SDS-PAGE蛋白电泳图Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of loach soup with different boiling time

2.3 不同熬煮时间对泥鳅汤游离氨基酸含量的影响

汤中的游离氨基酸有助于形成肉汤的鲜美滋味,提高其营养价值[19]。由表1可得,泥鳅汤中共检测到17种氨基酸,总游离氨基酸(TAA)含量随熬煮时间呈现先上升后下降趋势,在90 min时TAA达到最大值2957.20 μg/mL,随后急剧下降。在90 min时泥鳅汤中半胱氨酸(22.5%)、甘氨酸(19.0%)、丙氨酸(11.6%)和谷氨酸(9.6%)含量较高,其次为组氨酸、赖氨酸、脯氨酸以及亮氨酸,丝氨酸含量最少。其中,谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸具有不同程度的甜味和鲜味,还有呈苦味的组氨酸等,这些丰富的氨基酸赋予了泥鳅汤醇厚而鲜美的滋味[13]。在90 min之后,泥鳅汤中TAA急剧下降,这可能是因为泥鳅汤在熬煮过程中,肌肉中蛋白质受热降解成大小不同的小肽或者相应的游离氨基酸,通过物质交换溶出到汤汁中,当熬煮至一定时间,氨基酸会降解成肌苷酸和各类挥发性风味物质,这影响了氨基酸在泥鳅汤中的含量,同时肌肉中的纤维组织经过长时间熬煮会形成网状结构吸附汤中的游离氨基酸[20-22]。动物肌肉细胞中含有多糖,在热的作用下可水解生成单糖、双糖和低聚糖[16],与汤中的游离氨基酸产生美拉德反应,这可能也是造成游离氨基酸含量降低的原因之一。

从必需氨基酸总量(EAA)分析比较,在90 min时泥鳅汤中必需氨基酸含有缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸,较其他组种类齐全且含量最高,为664.3 μg/mL。从鲜味氨基酸含量(UAA)分析比较,随着熬煮时间的延长呈现先上升后下降的趋势。在90 min时含量最高,达到1296.7 μg/mL,远高于其他组;其中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸是泥鳅汤中主要的鲜味氨基酸,略不同于倪冬冬等[9]测得大鲵汤中主要鲜味氨基酸(丙氨酸、精氨酸、谷氨酸)的种类。

综上,在熬煮时间达到90 min时,泥鳅汤中游离氨基酸含量较高且必需氨基酸种类丰富,此时的鲜味氨基酸含量高,泥鳅汤醇厚鲜美。

2.4 不同熬煮时间对泥鳅汤抗氧化能力的影响

由图3可知,随着熬煮时间的增加,ABTS+·清除率逐渐上升,这可能是泥鳅在加热过程中蛋白质降解产生多肽和游离氨基酸,极性基团数量增多,导致亲水性增强,使其更容易与水溶性的ABTS+·发生作用,同时泥鳅多肽具有清除ABTS+·的能力[23]。在30～120 min时,ABTS+·清除率显著(P<0.05)上升,从18.01%升至43.61%,熬煮到120 min时,ABTS+·清除率为43.29%,随后略有下降。由于加热烹饪会影响肉类蛋白质的结构,使粗肽中更多的疏水性基团位点暴露,导致疏水性提高,使其更容易与水溶性的ABTS+·发生作用[24]。因此，ABTS+·清除率升高。

图3 不同熬煮时间对泥鳅汤ABTS+·和DPPH·清除率的影响Fig.3 Effect of different boiling time on ABTS+·and DPPH· scavenging rate of loach soup

泥鳅汤表现出较高的DPPH·清除能力,在熬煮时间30～90 min范围内,清除率显著(P<0.05)上升,从11.66%上升到84.10%,随熬煮时间延长,泥鳅中的脂肪溶出,汤中脂肪含量增加,使其容易捕获脂溶性的DPPH·,同时肌肉中多糖在熬煮过程中不断的溶出,而泥鳅中的多糖又具有清除DPPH·的作用[25];在90～120 min时DPPH·清除率趋于平稳(84.10%～87.25%),这可能是由于多糖降解的影响;在50 min时清除率上升至93.23%,DPPH·清除率升高是由于长时间的熬煮,某些游离氨基酸降解成一些残基,比如亲核侧链的Cys残基等,这些物质可以阻断自由基的链式反应[24]。

3 结论

在泥鳅汤的熬煮过程中,熬煮时间对泥鳅汤的营养成分和抗氧化活性产生了很大的影响。随熬煮时间的延长,汤中可溶性蛋白质含量显著上升,在150 min达到18.49 mg/mL;SDS-PAGE蛋白电泳显示,随着熬煮时间的延长,大分子蛋白质发生降解产生多肽和氨基酸,在90 min汤中游离氨基酸含量最高达到2957.20 μg/mL,鲜味氨基酸含量高达到1296.70 μg/mL,汤汁口感鲜美。在抗氧化性方面,随着熬煮时间的增加,汤中ABTS+·清除率和DPPH·的清除率整体呈上升趋势。综上,在烹饪台湾泥鳅汤时,熬煮90 min较为合理,此时台湾泥鳅汤的营养品质较好,且抗氧化能性强。