非小细胞肺癌中PD-L1、PD-1蛋白表达及其与EGFR基因突变的相关性研究

嵇晓辉 冯智坤 门颖丽 卫田田

肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占比最高，约80%以上[1]，严重危害人类健康。肺癌从传统的放化疗到分子靶向治疗，肿瘤耐药问题仍难以解决。近年来免疫疗法兴起，免疫治疗是利用患者自身的免疫系统来控制和清除肿瘤。程序性死亡配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）由90 个氨基酸组成，属于B7-28 超家族成员。研究表明，PD-L1 不仅在活化的T 细胞、B 细胞、单核细胞呈诱导性表达，并在胃癌、肺癌、食管癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中表达上调且参与肿瘤的免疫逃逸机制[2～7]。当前对于PD-L1、PD-1 与EGFR 基因突变相关性的研究较少，但也有研究提示PD-1/PD-L1 通路与EGFR 通路之间存在一定的相互作用[8]。本研究旨在探讨NSCLC 中PD-L1、PD-1 表达情况，分析其与EGFR 基因突变的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集2015年1月～2017年12月我院病理科确诊的50 例非小细胞肺癌患者肺癌组织及距肿物＞5cm 处相对正常肺组织，其中男35 例，女15例，年龄33～78 岁。所有患者术前均未行放化疗。

1.2 主要试剂鼠抗人PD-1 抗体（即用型）和兔抗人PD-L1 抗体分别购自福州迈新公司和基因科技（上海）有限公司，二抗及DAB 购自福州迈新公司；石蜡组织核酸提取及EGFR 基因突变检测试剂盒（PCR法）购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化 免疫组化采用Max Vision 法，组织切片经常规脱蜡、水化、抗原修复，一抗37℃孵育2h，二抗孵育30min 后，DAB 显色5～10min，苏木素复染2min，用PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 实时荧光定量PCR 核酸提取后的反应体系置于ABI7500 荧光定量PCR 仪中进行扩增。反应程序：第一阶段42℃ 5min，95℃ 5min，1 个循环；第二阶段95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，10 个循环；第三阶段93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，36 个循环。

1.4 结果判定PD-L1 主要表达于肿瘤细胞的胞膜和胞质。两人双盲观察，二级记分法。0～3 分表示细胞着色强度：无着色计0 分，淡黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分；按阳性细胞比例评分：阳性细胞＜1%为0 分，阳性细胞1%～10%为1 分，阳性细胞11%～49%为2 分，阳性细胞≥50%为3 分。染色强度与相应的百分比相乘，得分≥3 定义为阳性表达。PD-1 主要表达于活化T 细胞胞膜和胞质。细胞计数法评估，低倍镜下观察整张切片，寻找淋巴细胞密度高区域，并随机选取5 个高倍视野，每视野计数淋巴细胞100 个，PD-1 阳性细胞数为其平均值。以全部患者PD-1 阳性细胞数均数作为阈值，高于该阈值者为阳性表达，反之即为阴性表达[9]。

1.5 统计学分析采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，各组间样本率的比较及其与临床病理特征的关系采用χ2检验，相关性采用Pearson 相关性分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-L1、PD-1 蛋白在正常肺组织及非小细胞肺癌组织中的表达50 例肺癌组织中PD-L1 阳性率为52.00%（26/50），PD-1 阳性率为60.00%（30/50），正常肺组织中PD-L1、PD-1 阳性率均为0（0/50）。肺癌组织中PD-L1、PD-1 阳性率均高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P<0.05）。PD-L1 和PD-1 在肺癌组织中的表达见图1、2。

图1 PD-L1 在非小细胞肺癌组织中的表达

图2 PD-1 在非小细胞肺癌组织中的表达

2.2 PD-L1、PD-1 蛋白表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系PD-L1 和PD-1 蛋白在有淋巴结转移和无淋巴结转移患者中阳性率分别为75.00%和80.00%、36.67%和46.67%，在TNM 分期较低和较高者中阳性率分别为39.29%和68.18%、42.86%和81.82%，与淋巴结转移及TNM 分期有关，差异有统计学意义（P<0.05）；与患者年龄、性别、吸烟、肿瘤大小及分化程度无关（P>0.05），见表1。

2.3 PD-L1、PD-1 蛋白表达与EGFR 基因突变的相关性在PD-L1 和PD-1 蛋白表达阳性肺癌患者中EGFR 基因突变率分别为26.92%和30.00%，相关性分析表明，PD-L1 蛋白表达与EGFR 基因突变无相关性（r=0.176，P>0.05）；PD-1 蛋白表达与EGFR 基因突变无相关性（r=0.201，P>0.05）。

2.4 PD-L1、PD-1 蛋白在非小细胞肺癌组织中表达的相关性50 例非小细胞肺癌组织中PD-L1 蛋白表达阳性者26 例，其中20 例PD-1 蛋白表达亦阳性，阳性率为76.92%。经相关性分析，50 例非小细胞肺癌组织中PD-L1 蛋白与PD-1 蛋白表达呈正相关（r=0.336，P<0.05），见表2。

表1 非小细胞肺癌组织中PD-L1、PD-1 蛋白表达与临床病理特征及EGFR 基因突变的关系（n）

表2 非小细胞肺癌中PD-L1 和PD-1 蛋白表达的关系（n）

3 讨论

PD-1（CD279）是免疫球蛋白超家族I 型跨膜糖蛋白，由细胞外IgV 区、疏水性跨膜区、细胞质区组成，主要表达于活化的T 细胞表面，最早在小鼠T 细胞、B 细胞程序性细胞死亡中被发现。其配体为PD-L1（B7-H1/CD274）、PD-L2（B7-DC/CD273）。PD-L1、PD-L2 是I 型跨膜糖蛋白，由IgC 和IgV 结构域组成。PD-L1 广泛表达于T 细胞、B 细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及多种肿瘤细胞[10～12]，PD-L1 与PD-1 相结合可有效抑制活化淋巴细胞，导致T 淋巴细胞凋亡，此种免疫负调控作用致使肿瘤细胞免疫逃逸，最终导致肿瘤生长及扩散。免疫抑制剂的应用能够阻断信号通路，降低免疫逃逸的发生，加速肿瘤凋亡，达到消除肿瘤的目的。最新研究发现，PD-1/PD-L1 在肺腺样囊性癌中的表达率均较低[13]。研究显示NSCLC 中PD-L1 的阳性表达率为39.9%～53.1%，PD-1 为29.2%～75.0%[14]。本研究中肺癌组织PD-L1 阳性率为52.00%（26/50），PD-1 阳性率为60.00%（30/50），PD-L1 和PD-1 蛋白在肺癌组织中高表达。在26 例PD-L1 阳性患者中有20 例PD-1 蛋白表达阳性，阳性率为76.92%，经相关性分析，PD-L1 和PD-1 在非小细胞肺癌患者中的表达呈正相关，与文献报道一致[14]。同时，本研究发现，非小细胞肺癌患者中PD-L1 和PD-1的表达与患者年龄、性别、有无吸烟史、肿瘤大小以及分化程度均无关，但与淋巴结是否转移及TNM分期均有关，有淋巴结转移者较无淋巴结转移者PD-L1 和PD-1 的表达阳性率更高，且随着肿瘤分期程度升高PD-L1 和PD-1 的表达阳性率也越高。

EGFR 基因突变与非小细胞肺癌的研究是近年来的热点，PD-L1 可能在EGFR 突变型肺癌的发生发展中参与了免疫逃逸过程，利用免疫检查点阻滞剂抗体阻断PD-1 信号通路可能会抑制EGFR 突变型患者的肿瘤生长，延缓疾病进展，提高生存率。研究显示，肺腺癌中EGFR 野生型标本中PD-L1 和PD-1 的阳性率均高于突变型，但与突变类型无相关性[8]。另有研究认为，在NSCLC 中EGFR 突变型PD-L1 的阳性率更高，可能更适合PD-1 免疫制剂治疗[15]。本研究中，50 例非小细胞肺癌患者中17例存在EGFR 基因突变，其中PD-L1 蛋白阳性表达者仅7 例，表达阳性率为41.18%，而在33 例野生型EGFR 患者中有19 例PD-L1 蛋白表达呈阳性，表达阳性率为57.58%。相关性分析显示，非小细胞肺癌患者中PD-L1 蛋白表达与EGFR 基因突变之间未见明显相关性。

综上所述，目前对于EGFR 基因突变与PD-L1、PD-1 表达的相关性研究结果不一，大样本多中心的研究对于免疫及靶向治疗至关重要。此外，外周血中动态监测EGFR 基因突变与PD-L1、PD-1 的表达对于评估疾病进展与生存时间意义重大[16]。总之，PD-L1、PD-1 在非小细胞肺癌中的表达可作为判断预后的重要指标，是肺癌免疫治疗的新策略，化疗联合免疫治疗可使非小细胞肺癌患者在保证治疗安全的同时提高疗效，使晚期非小细胞肺癌患者从中获益。