AVPR2基因突变致X连锁先天性肾性尿崩症一例报告

刘竹枫，王文红，张瑄，陈文玉

先天性肾性尿崩症（congenital nephrogenic diabetes insipidus，CNDI）是一组遗传异质性单基因疾病，较少见，约占所有肾性尿崩症（NDI）的10%，其发病机制主要是由于垂体后叶素分泌的抗利尿激素（arginine vasopressin，AVP）信号转导途径缺陷，导致肾小管远端及集合管对AVP 反应不敏感或无反应。CNDI约90%为抗利尿激素受体2（AVPR2）基因突变所致，该基因为X连锁隐性遗传，其余10%由水通道蛋白2（AQP2）基因突变所致，为常染色体显性或隐性遗传。近年来，CNDI基因突变的遗传及分子机制成为该领域的研究热点，为该病在基因及分子水平上的诊断和治疗提供了可能性。AVPR2基因突变导致的X连锁CNDI的位点在逐渐增加，目前共发现 280 多 种AVPR2基 因 突 变［1］，中 国 发 现 32 个AVPR2基因位点突变，以错义突变为主，占 29 个［2］。CNDI 多在婴儿期发病，发病率较低，如临床医师不能充分认识，早期诊断及时治疗，会出现严重的并发症，如生长发育落后，智力低下，肾功能不全，甚至严重的电解质紊乱导致死亡。本研究报告1例确诊为CNDI的患儿，通过临床资料及基因检测明确诊断并治疗随访及文献复习。

1 病例报告

1.1 病例资料 先证者 男，4 月龄。生后24 d 因鼻塞、喉中痰鸣2 d、发热5 h，于2018 年1 月31 日入住我院新生儿科病房。体温波动在39.1～40.5 ℃之间，物理降温较难降至正常。个人史（即生产史）：系第1 胎第1 产，足月顺产，否认宫内窘迫及生后窒息史，母亲孕期无异常。入院查体：体质量3.5 kg，血压65/45 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），体格发育欠佳，神志清、精神反应可，呼吸平稳，无浮肿、皮肤弹性尚可，心肺腹查体未见明显异常，正常男性外生殖器，四肢肌力肌张力正常。血常规：血红蛋白126 g/L，白细胞计数11.13×109/L，中性粒细胞计数（N）0.426，血小板计数283×109/L；静脉血气：酸碱度（pH）7.41，二氧化碳分压［p（CO2）］34 mmHg，剩余碱（BEb）-2 mmol/L，血C反应蛋白（CRP）、血沉（ESR）正常，3次血培养阴性、3次尿培养阴性。大便细菌培养阴性，病毒培养提示轮状病毒阳性。血(1,3)-β-D葡聚糖：198.9 ng/L，提示真菌感染。电解质多次提示高钠高氯血症：血钠145～157 mmol/L，血氯114～119 mmol/L，肝肾功能大致正常，血肌酐31µmol/L，血尿素氮2.9 mmol/L。胸腹联合X线片示双肺纹理增粗，腹部未见异常。心电图正常，腹部超声肝脾肾未见异常。心脏超声示卵圆孔未闭、房间隔缺损。头部及垂体核磁显示双侧额顶叶脑室旁白质区片状长T1、稍长T2 信号影，筛窦蝶窦黏膜增厚，垂体平扫未见异常。尿常规：多次尿比重1.000～1.010，镜检阴性。诊断：（1）新生儿肺炎。（2）真菌感染。（3）轮状病毒肠炎。（4）高钠高氯血症原因待查。（5）卵圆孔未闭、房间隔缺损。入院后给予抗感染对症支持治疗，患儿体温有下降趋势，但高钠高氯血症难以纠正。入院后发现患儿喜饮水，尿量多。监测饮水量550～800 mL/d，尿量750～1 050 mL/d，垂体核磁检查未见异常（图1A），结合病史考虑尿崩症，家属拒绝禁水-加压素试验及基因检测，自动出院。2018 年 5 月 6 日因间断发热 18 d 第 2 次住院，入住我院肾脏病科。追问病史，患儿自上次出院后仍有多饮、多尿表现。先证者父母非近亲婚配，检测父母尿比重分别为1.020、1.025，除先证者外，患儿父母及其他家族成员否认疑似存在尿崩症的临床表现。复查头部及垂体核磁显示双侧额叶、顶叶脑室旁白质区片状稍长T1、稍长T2信号影较前范围缩小，垂体蝶鞍不大，垂体形态未见异常，高度约4.1 mm，垂体后叶短T1 信号消失。垂体柄居中、无增粗。双侧海绵窦区未见异常信号影（图1B）。征得患儿监护人知情同意，并签署知情同意书后行禁水-加压素试验（表1），禁水后每小时测尿比重，同时留尿常规、血液及尿液渗透压，监测6 h，患儿多次尿比重＜1.015，尿比重之差＜0.001，停止禁水试验，行加压素试验，皮下注射垂体后叶素（0.2 IU/kg），重复上述操作，密切监测患儿生命体征，患儿体质量降低5%，尿渗透压＜血渗透压，尿比重＜1.015，两次尿比重之差＜0.001，终止试验。本患儿禁水-加压素试验结果支持肾性尿崩症。

Fig.1 Pituitary MRI of the child with congenital renal diabetes insipidus图1 CNDI患儿垂体核磁影像

1.2 基因检测方法 为明确诊断，先证者及其父母行基因检测。（1）目标序列捕获与测序。抽取先证者及其父母静脉血2 mL，采用德国Qiagen公司QIAamp DNA Blood Midi Kit 按照标准流程提取基因组DNA。利用美国Massachusetts 公司Covaris LE220 超声波仪将基因组DNA 打断成主带为100～500 bp 小片段DNA，然后将打断后的DNA 片段进行磁珠筛选，筛选后的主片段大小为150～200 bp，末端补平后，在3'端加腺嘌呤（A），使得DNA 片段能与3'端带有胸腺嘧啶（T）的特殊接头连接，从而完成单个受检者的DNA 文库。Non-Captured样品进行LM-PCR反应，纯化，利用定制的基因片段捕获探针（Roche NimbleGen，Madison，USA），与10～20个标记好的患者DNA文库47 ℃杂交16～24 h，杂交结束后进行探针的洗涤和洗脱反应，随后进行Captured 样品的LM-PCR 反应。文库经Agilent 2100 Bioanalyzer 和BMG 进行片段大小、浓度检测，合格后将需要不同数据量的文库进行pooling、定量；然后将pooling 文库进行单链环化。环化后的文库经过make DNB 后利用高通量测序仪BGISEQ-500 连续双向测序50个循环，并读出原始测序数据。（2）序列分析。数据下机后进入信息分析部分。首先对下机的原始数据（Raw reads）进行测序质量评估，去除低质量以及被接头污染的reads。随后用BWA软件（Burrows Wheeler Aligner）与HG19/HG20进行序列比对，与此同时进行序列捕获效果评价，用GATK 软件进行 SNV（single nucletide variant）和 Indel（insertion and deletion）的查询，生成目标区域碱基多态性结果，随后进行数据库（NCBI dbSNP，HapMap，1 000 human genome dataset 和database of 100 Chinese healthy adults）的比对，并对找出的可疑突变进行注释、筛选。（3）Sanger法测序验证。对于所有发现的致病突变，在其所在片段上下游设计引物。进行PCR扩增，对产物做Sanger 测序，从而验证基因芯片捕获和高通量测序的结果。

Tab.1 The results of water deprivation vasopressin test of the child表1 患儿禁水-加压素试验结果

1.3 基因检测结果 先证者AVPR2基因亚区发现1 处新发突变：c.359T＞G，为半合子突变，突变类型为错义突变，导致氨基酸改变：p.Met120Arg，该基因位于X染色体上，先证者母亲在AVPR2同样的基因位点存在新发突变：c.359T＞G，为杂合突变，与先证者突变序列相同，受检者父亲无此突变，见图2。理论上先证者母亲为新发突变的携带者，先证者的AVPR2基因突变为新发突变，来源于母亲，表型和X 连锁隐性遗传性先天性尿崩症相吻合。

1.4 治疗及随访 给予患儿氢氯噻嗪2 mg/（kg·d），其尿量减少20%～30%，体温降至正常，出院。患儿出院后目前调整为氢氯噻嗪联合阿米洛利治疗，门诊随访1年，患儿存在生长发育落后，偶有低热，尿量减少至30%～40%。

Fig.2 AVPR2 gene sequencing results图2 AVPR2基因测序结果

2 讨论

国外报道AVPR2基因突变所致的CNDI，大约25万例男性中有1例发病［3］。一项加拿大的研究显示，在魁北克出生男婴的X 连锁CNDI 发病率约为8.8/100万，约50%的AVPR2基因突变患者家系中可发现女性携带者，而其余患者为新发突变［4］。AVPR2基因位于染色体Xq28 区，由3 个内含子和2个外显子组成，编码1 个含有371 个氨基酸的蛋白，为G 蛋白偶联受体。生理状态下，AVP 与位于肾集合管基底膜主细胞上的AVPR2受体结合，激活腺苷酸环化酶（cyclic adenosine monophosphate，CAMP）产生级联效应，从而激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），使细胞内的AQP2磷酸化，易位到主细胞膜顶膜，发挥水的重吸收作用，实现尿液浓缩［5］。当AVPR2或AQP2基因位点突变造成远端肾单位对AVP 的抗利尿激素作用不敏感或无反应，导致尿液浓缩功能障碍，从而发生CNDI。

AVPR2基因突变导致X连锁CNDI，临床上男性患者常见，而杂合子女性患者由于X 染色体的失活偏倚出现不同的临床表型，临床表现多样，多饮、多尿的程度可有明显不同［1］。AVPR2基因突变导致的X 连锁CNDI 的位点在逐渐增加，目前共发现280 多种AVPR2基因突变，以错义突变为主［1］，中国目前已发现32个AVPR2突变位点，错义突变占29个［2］。根据基因序列分析及亚细胞分类将AVPR2基因突变分为5 类：第1 类突变干扰了mRNA 正确的转录、加工与翻译，产生了截短蛋白质，这些蛋白通常被迅速降解；第2 类突变最为常见，AVPAR2基因的错义突变或插入、缺失产生了全长蛋白，使蛋白错误折叠，虽然保持了内在的功能，但由于内质网的质控机制与蛋白酶体降解的靶向性，使错误折叠蛋白被滞留在内质网内，不能在细胞膜表面正常表达；第3类突变导致了血浆中膜表达受体与Gs 蛋白结合能力的下降，从而导致磷酸化途径激活减弱，影响与Gs 蛋白的耦联；第4类突变导致对抗利尿激素亲和力降低，突变虽然没有影响AVPR2在细胞膜上的正常表达，但是与AVP 结合能力下降；第5 类突变被误传到不同亚细胞器中，突变基因可能编码合成正常的受体蛋白，但在细胞内错误定位，不能在细胞膜上正常表达［6-7］。此外，AVPR2突变也会发生“功能增益”，这些突变受体过度增加了对AVP 的亲和力，导致肾源性的抗利尿激素不适当分泌［8］。

CNDI 多于婴幼儿期发病，若饮水充分，患儿一般状况可正常，无明显体征，或仅有发热、易激惹、便秘、呕吐、生长障碍等非特异表现，临床医师认识不足易误诊、漏诊，耽误最佳的治疗时机，严重可致智力障碍、生长发育迟缓、肾积水、肾功能不全、严重的电解质紊乱导致死亡。禁水试验可初步判定患者是否为尿崩症，禁水-加压素试验可以进一步区分神经性尿崩症和肾性尿崩症，即给予外源性AVP 或去氨加压素后，尿渗透压变化不明显或升高不超过50%，诊断为肾性尿崩症［9］。CNDI 在肾性尿崩症中仅占约10%，应慎重排除继发性肾性尿崩症。然而，有报道称少数CNDI 患者在禁水试验或外源性注射AVP后，尿液浓缩能力明显增加［10］，临床称为不完全型CNDI。这种残存的尿浓缩能力可能是为了防止严重高渗脱水的发生。迄今，所有已证实为AVPR2基因错义突变患者中，有17 例不完全型X-CNDI表型［10-11］。

儿童行禁水-加压素试验应密切监测生命体征，以防出现脱水、电解质紊乱、休克、惊厥等并发症。通常禁水6 h已足够，体质量下降超过5%则需终止试验。禁水后尿渗透压达不到血渗透压的2.5 倍以上，而血渗透压增高＞305 mOsm/kg 可终止试验，诊断为尿崩症，其中尿渗透压＜血渗透压者为完全性尿崩症，尿渗透压＞血渗透压者为部分性尿崩症。小婴儿若血尿渗透压留取困难或医疗条件有限，可用尿比重计，禁水后每小时测尿比重，同时留尿常规，若尿比重进行性增高，继续留尿，若两次尿比重之差＜0.001，停止禁水试验，行加压素试验，皮下注射垂体后叶素（0.1～0.2 IU/kg或5 IU/m2），重复上述操作，持续留尿至两次尿比重之差＜0.001支持肾性尿崩症，或尿比重达1.015 以上提示垂体性尿崩症。正常的垂体后叶呈现高信号是由于垂体后叶内有含抗利尿激素的神经分泌颗粒，一般认为垂体后叶T1W1 信号强弱与后叶血管加压素含量密切相关，本例患儿基因结果未回报前，垂体核磁短期内出现T1W1 信号由正常变为消失，临床考虑是否为中枢性尿崩症，而禁水-加压素试验支持肾性尿崩症，给临床诊疗造成了很大困扰，也曾试用AVP 治疗，患儿症状无改善，换用氢氯噻嗪及阿米洛利治疗，患儿症状明显改善，基因结果也支持肾性尿崩症的诊断。该患儿的垂体T1信号消失分析原因可能是与患儿病史较长，持续脱水未能完全纠正有关，导致垂体后叶AVP 含量减少有关，垂体后叶AVP 含量降低，垂体核磁T1加权像也会呈现高信号缺乏。

由于该症较少见且存在异质性，当出现不完全型CNDI 或因失活偏倚导致临床症状轻微甚至无症状的X连锁CNDI的杂合子女性患者，通过传统的方法进行鉴别诊断较为困难。这时基因诊断显得尤为重要，通过检测AVPR2和AQP2不仅可以早期明确诊断，使患者得到及时治疗，防止出现智力障碍、发育落后等严重并发症，并为家族性病例提供遗传学帮助，以及为突变基因携带的成年女性提供产前筛查。

CNDI 治疗现状主要是对症治疗而非针对病因治疗。对症治疗的目的是补液同时联合低盐低蛋白饮食，防止脱水。药物治疗常用利尿剂和非甾体抗炎药。氢氯噻嗪通过抑制远曲小管对Na的重吸收，使尿量减少。近期研究发现，氢氯噻嗪可减少锂诱导肾性尿崩症小鼠近端小管对Na的重吸收，减少尿量，同时氢氯噻嗪可以促进AQP2 在小鼠集合管上皮细胞的表达［12］。但长期单一用药效果不佳，目前不作为首选［13］。氢氯噻嗪［2～4 mg/（kg·24 h）］联合阿米洛利［0.3 mg/（kg·24 h）］，能使患者尿量降低50%，耐受性较好，减少低钾血症的发生，是目前推荐的临床一线用药［14］。

随着CNDI 分子生物学的发展以及发病机制的阐明，目前产生了很多针对病因的新型治疗手段，根据CNDI 的类型不同，治疗的靶点和策略也有所不同，针对CNDI的病因治疗研究目前主要集中于3方面：（1）修复错误折叠蛋白，使其恢复正常的蛋白结构并从滞留的内质网中脱离，进而正确定位到细胞膜表面［6］。（2）直接作用于滞留在内质网中错误折叠的受体蛋白发挥作用［6］。（3）不通过AVPR2介导，直接激活AQP2［3］。但应用于临床的安全性和有效性尚需进一步评估。