长林4号油茶幼苗对低温胁迫的生理响应

胡倩 裴云霞 倪天虹 耿若楠 张娟娟 余金金 杜克兵 周忠诚

摘 要： 為探究油茶幼苗对低温胁迫的生理生化响应机制，本研究以湖北省主栽油茶品种长林4号的2 a生幼苗为试验材料，研究了其表型、叶片气体交换参数以及相关生理指标对低温胁迫（4 ℃和-4 ℃）的响应。结果表明：①低温胁迫显著影响了长林4号油茶幼苗的形态特征，使嫩茎和叶片出现不同程度的萎蔫和失水症状，并且-4 ℃处理比4 ℃处理植株受损程度更严重。②低温胁迫显著降低了油茶叶片的气体交换参数（Pn、Gs、Tr、RWUEi）值，恢复期间其值仍持续下降，且-4 ℃处理的抑制作用显著强于4 ℃处理。③低温胁迫虽然降低了油茶叶片的SPAD值，但未达到显著水平。④低温胁迫显著提高了油茶叶片中的MDA、Pro和可溶性糖含量。恢复期间，4 ℃处理的MDA和Pro含量略有下降，而可溶性糖含量仍继续增加;-4 ℃处理的MDA和可溶性糖含量略有下降，Pro含量仍继续增加。（5）低温胁迫显著影响了油茶叶片中的抗氧化酶活性。随着胁迫时间的延长，SOD和POD活性持续上升，而CAT活性则先上升后下降，并且-4 ℃处理的上升幅度明显高于4 ℃处理;恢复期间，抗氧化酶活性均有不同程度的降低。

关键词： 油茶;低温胁迫;表型;生理生态特征

中图分类号：S794.4   文献标识码：A   文章编号：1004-3020（2020）06-0005-08

Abstract： In order to explore the physiological and biochemical response mechanism of C.oleifera seedlings to low temperature stress，this experiment took the 2-year-old seedings of C.oleifera‘Changlin4 as the experimental material to study the response of its phenotype、leaf gas exchange parameters and related physiological indicators under cold stress （4 ℃and -4 ℃）.The results showed that： ① Cold stress significantly affected the morphological characteristics of C.oleifera ‘Changlin4，causing wilting and water loss symptoms of the young stems and leaves in different degrees，and the degree of plant damage was more serious under -4 ℃ treatment than under 4℃ treatment.② Cold stress significantly reduced the values of gas exchange parameters （Pn、Gs、Tr、RWUEi） in the leaves of C.oleifera，which continued to decline during the recovery period，and the inhibition effect of -4 ℃ treatment was significantly stronger than that of 4 ℃.③ Although cold stress reduced the SPAD value of C.oleifera，it did not reach a significant level.（4） Cold stress significantly increased the content of MDA，Pro and soluble sugar in the leaves of C.oleifera.During the recovery period，the MDA and Pro content of 4 ℃ treatment decreased slightly，while the soluble sugar content continued to increase;the MDA and soluble sugar content of -4 ℃ treatment decreased slightly，while the Pro content continued to increase.（5） Cold stress significantly affected the activity of antioxidant enzymes in the leaves of C.oleifera.With the extension of stress time，SOD and POD activities continued to increase，while CAT activities first increased and then decreased，and the increase of -4 ℃ treatment was significantly higher than that of 4 ℃;during the recovery period，the activity of antioxidant enzymes decreased in varying degrees.

Key words： Camellia oleifera;cold stress;phenotype;eco-physiological characteristics

油茶Camellia oleifera是山茶科Theaceae山茶属Camellia中油脂含量较高且具有经济价值的一类植物的总称，被誉为“东方橄榄油”[1]。油茶在中国已经有2000多年的栽培历史，其适应能力强，经济价值高，是一种常绿阔叶的经济树种[2]。截止2018年，中国现有油茶林已达到436.67万hm2，主要分布在江西、湖南、浙江、福建、广西等省区[3-4]。湖北省是中国油茶北部中心产区，也是油茶生长的边缘地区，主要栽培的油茶有长林4号C.oleifera ‘Changlin4、长林18号C.oleifera ‘Changlin18、长林23号C.oleifera ‘Changlin23、长林40号C.oleifera ‘Changlin 40、谷城大红果8号C.oleifera ‘Guchengdahongguo8等品种[5]。近年来，湖北省油茶产业发展迅速，但是低温对油茶栽培造成了许多不利影响，常常导致植株幼苗出现不同程度的冻害现象，造成巨大的经济损失。

目前，中国科研工作者在油茶良种选育、分子育种、栽培技术以及茶油提取等方面做出了大量的研究[6-8]。关于油茶低温胁迫的研究虽有报道，但针对长林4号油茶品种抗寒性生理的研究却较少。为了探究油茶对低温逆境的生理响应，本研究以长林4号油茶为试验材料，针对低温胁迫对其表型、叶片气体交换参数以及相关生理指标的影响进行了研究，以期为湖北省油茶栽培提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为2 a生长林4号C.oleifera‘Changlin4的嫁接苗（以油茶实生苗为砧木）。

1.2 试验方法

1.2.1 植株培养

于2017年秋季，将1 a生油茶嫁接苗移栽于规格为10.5 cm×8.5 cm×20.0 cm的营养钵中，置于室内培养，室内温度为（25±2）℃，光照强度为500 μmol·（m2·s）-1，光照时间为16 h·d-1，光源为白色冷光灯，室内空气相对湿度为70%～80%。苗木培养基质为蛭石和营养土（1︰3，v/v）的混合物，其pH值为5.5，基质中含有大量的N、P2O5、K2O（2%～5%）和有机质（>20%）。植株随机排列，培养期间进行常规管理。2018年9月，当植株高度达到30～35 cm、地径为3.0～3.5 cm时，选取大小、长势基本一致的苗木进行低温胁迫试验。

1.2.2 低溫处理

试验共设3个温度处理（25、4、-4 ℃），采用LED智能光照培养箱（武汉瑞华仪器设备有限公司）进行试验。将植株分别置于3个不同的培养箱内，随机排列，温度分别设为25 ℃、4 ℃和-4 ℃，培养箱内的其他环境条件与培养室保持一致。在低温分别为4 ℃和-4 ℃的处理过程中，将箱内温度进行每分钟降低2 ℃的降温处理，直至达到所设定的温度后开始计算低温胁迫的时间。

1.2.3 测定方法

将每个温度处理下的植株随机分为2组：一组用于表型、叶片气体交换参数、叶绿素含量（SPAD值）等无损伤性指标的观测;另一组用于丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、可溶性糖、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等生理指标的测定。具体试验和观测方法如下：

4 ℃和-4 ℃处理：先将植株分别置于4 ℃和-4 ℃条件下处理72 h，随后移至25 ℃的培养箱内恢复24 h，共处理96 h。期间，分别于4 ℃和-4 ℃处理的前1天（处理0 h）、处理6、24、48、72 h和恢复24 h（处理96 h）时观测植株的表型变化、叶片气体交换参数和SPAD值。同时采集植株叶片，于液氮中速冻后于-80 ℃下保存，用于MDA、Pro、可溶性糖含量以及SOD、POD、CAT活性等生理指标的测定，3次重复/处理。

25 ℃处理：将植株置于25 ℃培养箱下培养，然后分别于处理0、6、24、48、72 h和恢复24 h（处理96 h）时，进行上述指标的观测与样品采集，3次重复/处理。

相关指标的观测方法为：

（1）叶片气体交换参数与SPAD值的测定：固定选取植株顶端完全展开的第4～5片嫩叶进行测定。叶片气体交换参数测定时间为上午10∶00～12∶00，采用LI-6400光合测定仪（LI-COR Inc.，Lincoln，NE，USA）测定。测定时，采用标准LI-COR叶室，红蓝光源（6400-02 LED光源），设定光照强度为1500 μmol/（m2·s），空气流速为500 μmol/s，测定指标主要包括净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）和环境CO2浓度（Ca），以及相应的周围环境条件，如叶面温度、大气相对湿度、光合有效辐射等。瞬时水分利用效率（RWUEi）的计算公式[9]为：RWUEi=Pn/Gs。采用SPAD-502plus叶绿素测定仪（Konica Minolta Inc，Japan）测定叶片相同部位的SPAD值。每个叶片测定5次，取其平均值作为该叶片的SPAD值。

（2）生理指标测定：采用TBA法（硫代巴比妥酸）测定MDA含量;采用酸性茚三酮法测定Pro含量;采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量;采用NBT（氮蓝四唑）光化学还原法测定SOD活性;采用愈创木酚法测定POD活性;采用高锰酸钾滴定法测定CAT活性[10]。

1.3 数据分析

图中数据均为平均值±标准误（n=3）。方差分析、多重比较（Duncans）采用SAS8.1软件（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）进行。采用低温变化率评价低温处理对各个指标的影响程度。低温变化率=（25 ℃对照值-低温处理值）/25 ℃对照值×100%。

2 结果与分析

2.1 植株形态

低温胁迫下植株的表型变化特征如图1所示。25 ℃处理下，植株叶片和嫩茎的生长都正常，均未出现受害症状。4 ℃处理下，处理前期植株均未出现受害症状;至72 h时，所有植株下部成熟叶片未出现明显受害症状，而其上部嫩叶和嫩茎有不同程度的受害症状，主要表现为叶片萎蔫和失水，恢復期间略有好转。与4 ℃处理相比，-4 ℃处理下植株的受害程度更加严重。在处理48 h时，植株上部嫩叶开始出现萎蔫的症状;至72 h时，其嫩茎、嫩叶和下部成熟叶均出现明显的变褐、萎蔫和失水症状，恢复期间未出现明显好转。可见，-4 ℃处理72 h已经对长林4号油茶幼苗造成了较为严重的伤害。

2.2 叶片气体交换参数

温度、处理时间以及两者的交互作用显著影响了油茶叶片的净光合速率（Pn，p<0.05;图2）、气孔导度（Gs，p<0.05）、蒸腾速率（Tr，p<0.05）和瞬时水分利用率（RWUEi，p<0.05）。

对于Pn，25 ℃条件下，Pn值比较稳定，无明显变化（图2）。4 ℃和-4 ℃条件下，Pn在6 h时略有上升，随后开始下降，恢复期间仍持续降低，并于96 h时达到最低值，在6 h-24 h期间Pn值下降速度最快。与4 ℃相比，-4 ℃处理在每个时间点下降的幅度更大。至72 h时，-4℃和4℃处理的低温变化率分别达到81.61%和58.75%;至96 h时，分别达到99.07%和93.06%（表1）。

对于Gs，25 ℃条件下，其值比较稳定，无明显变化（图2）。4 ℃和-4 ℃条件下，Gs呈下降趋势，恢复期间仍持续降低，并于96 h时达到最低值，其中0～6 h期间Gs值下降速度最快。与4 ℃相比，-4 ℃处理在每个时间点下降的幅度更大。至72 h时，-4 ℃和4 ℃处理的低温变化率分别达到63.28%和54.16%;至96 h时，分别达到83.14%和65.02%（表1）。

Tr的变化趋势与Gs相似，在25 ℃条件下，其值比较稳定，变化幅度不大（图2）。4 ℃条件下，Tr值除了在48 h时有小幅上升之外，试验期间持续降低，并于96 h时达到最低值。-4 ℃条件下，Tr在整个试验期间持续降低，并于96 h时达到最低值，在6～24 h期间Tr下降速度最快。与4 ℃相比，-4 ℃处理随着胁迫时间的延长下降的幅度更大。至72 h时，-4 ℃和4 ℃处理的低温变化率分别达到55.74%和45.85%;至96 h时，分别达到了89.84%和66.96%（表1）。

对于RWUEi，其值在25 ℃条件下比较稳定，无明显变化（图2）。4 ℃条件下，RWUEi在6 h时明显上升，随后下降，在48 h时又有小幅上升，随后持续下降，并于96 h时达到最低值，在48～72 h期间RWUEi值下降速度最快。-4 ℃条件下，RWUEi在6 h时明显上升，随后下降，在48～72 h时又有小幅上升，恢复期间开始下降，并于96 h时达到最低值，其中6～24 h期间RWUEi值下降速度最快。与4 ℃相比，-4 ℃处理对RWUEi的抑制作用更加显著。至72 h时，-4 ℃和4 ℃处理的低温变化率分别达到46.04%和6.49%;至96 h时，分别达到94.49%和80.29%（表1）。

2.3 叶绿素与丙二醛含量

温度、处理时间以及两者的交互作用对油茶叶片的叶绿素含量影响不显著（SPAD，p>0.05），而对油茶叶片的丙二醛含量影响显著（MDA，p<0.05;图3）。

对于SPAD，25 ℃条件下，SPAD值比较稳定，无明显变化（图3）。4 ℃和-4 ℃条件下，SPAD值均呈持续下降趋势，但是下降幅度不大，在72 h时达到最低值，恢复期间略有上升。与4 ℃相比，-4 ℃处理在每个时间点下降的幅度更大。至72 h时，-4 ℃和4 ℃处理的低温变化率分别达到4.11%和3.22%;至96 h时，分别达到3.82%和3.07%（表1）。

就MDA而言，25 ℃条件下，其值比较稳定，变化幅度不大（图3）。4 ℃和-4 ℃条件下，MDA含量均呈上升趋势，并于72 h时达到最大值，恢复期间略有下降，其中48～72 h期间MDA含量上升速度最快。与4 ℃相比，-4 ℃处理在每个时间点上升的幅度更大。至72 h时，-4℃和4℃处理的低温变化率分别达到58.28%和20.25%;至96 h时，分别达到61.29%和22.26%（表1）。

2.4 脯氨酸与可溶性糖含量

温度、处理时间以及两者的交互作用显著影响了油茶叶片的脯氨酸（Pro，p<0.05;图4）和可溶性糖含量（p<0.05）。

Pro的变化趋势与MDA相似，25 ℃条件下，Pro含量比较稳定，无明显变化（图4）。4 ℃条件下，Pro含量呈缓慢上升趋势，并于72 h时达到最大值，恢复期间略有下降，在48～72 h期间Pro含量上升速度最快。-4 ℃条件下，Pro含量上升速度较快，恢复期间仍在上升，并于96 h时达到最大值，其中0～6 h期间Pro含量上升速度最快。与4 ℃相比，-4 ℃处理在每个时间点上升的幅度更大。至72 h时，-4 ℃和4 ℃处理的低温变化率分别达到130.85%和65.37%;至96 h时，分别达到了142.12%和65.74%（表1）。

对于可溶性糖含量，25 ℃条件下，其值比较稳定，无明显变化（图4）。4 ℃和-4 ℃条件下，可溶性糖含量在整个试验期间均呈持续上升趋势，恢复期间仍在上升，并于96 h时达到最大值，其中0～6 h期间可溶性糖含量上升速度最快。与4 ℃相比，-4 ℃处理随着胁迫时间的延长上升的幅度更大。至72 h时，-4 ℃和4 ℃处理的低温变化率分别达到77.94%和39.63%;至96 h时，分别达到72.06%和49.02%（表1）。

2.5 抗氧化酶活性

温度、处理时间以及两者的交互作用显著影响了油茶叶片的超氧化物歧化酶活性（SOD，p<0.05;图5）、过氧化物酶活性（POD，p<0.05）和过氧化氢酶活性（CAT，p<0.05）。

对于SOD和POD活性，两者的变化趋势相似，25 ℃条件下，其活性均比较稳定，变化幅度不大（图5）。4 ℃和-4 ℃条件下，其活性均呈持续上升趋势，并于72 h时达到最大值，恢复期间略有下降，在0～6 h期间两者活性上升速度最快。与4 ℃相比，-4 ℃处理在每个时间点上升的幅度更大。至72 h时，-4 ℃和4 ℃处理下SOD的低温变化率分别达到15.74%和11.83%，POD的低温变化率分别达到95.97%和57.06%;至96 h时，-4 ℃和4 ℃处理下SOD的低温变化率分别达到7.97%和4.30%，POD的低温变化率分别达到53.63%和19.15%（表1）。

对于CAT活性，25 ℃条件下，CAT活性比较稳定，无明显变化（图5）。4 ℃和-4 ℃条件下，CAT活性均呈先上升后下降的趋势，在48 h时达到最大值，随后下降，恢复期间仍持续降低，并于96 h时达到最低值。其中，4 ℃条件下在24～48 h期间CAT活性上升速度最快，-4 ℃條件下0～6 h期间上升速度最快。与4 ℃处理相比，-4 ℃处理在每个时间点上升的幅度更大。至72h时，-4 ℃和4 ℃处理的低温变化率分别达到31.30%和17.07%;至96 h时，分别达到12.60%和3.54%（表1）。

3 结论与讨论

3.1 结论

本试验研究表明，低温胁迫显著影响了长林4号油茶的形态特征，使嫩茎和叶片出现不同程度的萎蔫和失水症状，并且-4 ℃处理比4 ℃处理植株受损程度更严重。对于叶片各气体交换参数，低温胁迫使Pn、Gs、Tr值均有不同程度的降低，恢复期间，Pn、Gs、Tr值仍持续下降，且-4 ℃处理的抑制作用显著强于4 ℃处理。RWUEi在4 ℃低温处理的前48 h明显高于对照，-4 ℃处理的前6 h略高于对照，之后均低于对照，恢复期间，RWUEi均略有下降。对于叶绿素含量，低温胁迫虽然降低了油茶叶片的SPAD值，但未达到显著水平。对于MDA、Pro和可溶性糖含量，低温胁迫显著提高了其含量，恢复期间，4 ℃处理的MDA和Pro含量略有下降，而可溶性糖含量仍继续增加;-4 ℃处理的MDA和可溶性糖含量略有下降，Pro含量仍继续增加。对于抗氧化酶活性，低温胁迫显著提高了油茶叶片中的抗氧化酶活性，随着胁迫时间的延长，SOD和POD活性持续上升，而CAT活性则先上升后下降，并且-4 ℃处理的上升幅度明显高于4 ℃处理;恢复期间，抗氧化酶活性均有不同程度的降低。

3.2 讨论

3.2.1 低温胁迫对油茶幼苗形态及光合性能的影响

表型指标是显示植物在低温胁迫下受害程度最直接的指标。本研究中，4 ℃处理的植株仅有嫩叶与嫩茎出现不同程度的表型损伤，而-4 ℃处理的植株其嫩叶、嫩茎和成熟叶片均出现了明显的表型损伤，说明-4 ℃低温对2年生油茶幼苗的伤害更大，且处理72 h便出现不可逆的伤害，这与王永红等[11]采用油茶离体叶片在低温胁迫下的研究结果一致。光合作用是决定植物发育的主要因素，往往会受到各种环境因子的影响，其中温度是一个较为重要的影响因子。低温对光合作用的影响体现在光合器官的结构和活性、叶片气孔导度、参与光合作用的酶活性等方面[12]。叶片气体交换参数、叶绿素含量均为显示逆境胁迫下植物光合性能的重要指标[13]。低温胁迫下，相关指标的变化率常常可以反映植物的受害程度，变化率越大，说明植物受害越严重[14]。本试验中，低温胁迫导致长林4号油茶叶片的Pn、Gs、Tr、RWUEi等气体交换参数值均有不同程度的降低。与4 ℃处理相比，-4 ℃处理下降的幅度更大;恢复期间，这些参数值均未升高，甚至仍持续降低，这一结果与王雨水等[15]对‘杂优闽1油茶的研究结果相似，说明4 ℃和-4 ℃低温对油茶幼苗有较大的伤害，且温度越低伤害越大，并难以在短时间内恢复，与植株的表型结果基本一致。试验中发现，低温胁迫下叶片的SPAD值与对照相比虽然略有降低，但是差异不显著，这表明低温造成光合性能降低的主要因素是生理代谢或者气孔因素，而不是叶绿素含量的降低。

3.2.2 低温胁迫对油茶幼苗丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量的影响

植物在低温胁迫的环境下，细胞膜会发生膜脂过氧化反应，膜脂过氧化物分解产生丙二醛，其含量高低与植物抗逆性强弱呈负相关关系[16]，脯氨酸和可溶性糖是重要的渗透调节物质，能够保持细胞内环境的稳定，维持细胞代谢平衡，降低植物受害程度[17]。因此，丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量是显示植物抗寒性重要指标。本试验中，这些指标值均有不同程度的升高。在4 ℃条件下，这些指标上升的幅度比较缓慢，在0～24 h期间增幅不大，至48 h时开始迅速增加，恢复期间略有下降，这与王国霞等[18]对‘大别山1号、‘豫油茶1号、‘豫油茶3号油茶的研究结果相似。说明在低温处理前期植物受伤害程度较小，细胞液渗透率不大，细胞膜结构完整，能够维持正常的生理代谢活动。随着胁迫时间的延长，植物受伤害程度逐渐增大，细胞膜脂过氧化程度加剧，细胞内环境失去平衡，不能维持正常的生理代谢。恢复期间，丙二醛和脯氨酸含量均有不同程度降低，说明油茶能够耐受一定程度的低温，且通过生理调控可以维持一定的时间。与4 ℃处理相比，-4 ℃处理下这些指标在每个时间点上升的速度更快，这与文佳等[19]对‘大别山1号油茶的研究结果相似，说明油茶幼苗虽然能够形成低温适应机制，表现出一定的抗寒性，但是超出其抗寒性所能抵御的范围时，就会导致油茶幼苗代谢功能严重失衡，膜脂过氧化程度加剧，细胞膜结构严重受损。

3.2.3 低温胁迫对油茶幼苗抗氧化酶活性的影响

一般来说，活性氧自由基在植物体内都有分布，但是含量不高，处于产生和清除的平衡状态，对植物的新陈代谢不产生影响。当植物受到低温胁迫时，细胞的防御能力会下降，植物体内会产生大量的活性氧，造成活性氧自由基等物质的积累。SOD和POD可以清除细胞内的活性氧和自由基，降解植物代谢产生的H2O2，降低膜脂过氧化程度，保持细胞内自由基的平衡，CAT能够清除线粒体和膜脂过氧化产生的活性氧，提高植物对低温胁迫的适应性[19-21]。这3种抗氧化酶与植物的抗寒性密切相关，已经被大量研究所证明[22-24]。梁大伟[22]等研究了自然降温对红花玉兰抗寒性生理指标的影响，结果表明随着温度的降低，SOD、POD和CAT这3种酶活性逐渐增大，但达到一定胁迫程度后会逐渐下降。蒋景龙等[25]对汉中主栽柑橘品种在低温胁迫下的生理响应进行了研究，结果表明SOD、POD和CAT这3种酶活性均表现出先升高后降低的趋势。本研究表明，在25 ℃条件下，这3种酶活性均比较稳定，变化幅度不大。4 ℃和-4 ℃条件下，这3种酶活性会出现不同程度的上升，其中SOD和POD活性呈持续上升趋势，CAT活性呈先上升后下降趋势，恢复期间，这3种酶活性均有不同程度的下降。并且与4 ℃处理相比，-4 ℃处理在每个时间点上升的幅度更大，这与已有的研究结果相似。说明低温胁迫可以诱导抗氧化物酶活性的增加，减少细胞内自由基和活性氧的积累，从而提高油茶幼苗的抗寒性，但是随着处理溫度的降低，胁迫时间的延长，植株受伤害程度逐渐加深，其体内抗氧化系统会遭到破坏，导致酶活性逐渐下降。

参 考 文 献

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（责任编辑：唐 岚）