柱前衍生化HPLC法分析马卡列丙多糖中单糖的组成*

2020-03-31龚开妍智馨君谭紫玲刘良红

广州化工 2020年5期

龚开妍，智馨君，朱恋，谭紫玲，刘良红，蔡伟

(湖南医药学院药学院，湖南怀化 418000)

马卡列丙(侗药名),拉丁名为Duhaldeanervosa(Wallich.ex Candelle)A.Anderberg,又称毛秀才，小黑药，是菊科羊耳菊属显脉旋覆花的多年生草本植物[1],主要分布于我国西南地区和东南亚等地[2]。马卡列丙，在云南可作为香料食用，亦可作为民间药物，具有祛风寒, 通经络, 消积止痛等功效，主要用于风湿疼痛, 脘腹冷痛,偏头痛，跌打损伤，骨折等疾病的治疗[3-4]。马卡列丙中除了含有萜类，甾体等成分[5-6]，还含有本课题组前期研究发现的绿原酸类和多糖类成分[7-8]。多糖是生物体内重要的生物大分子，具有抗肿瘤，增强免疫力等多种药理作用[9-11]。多糖的单糖组成是多糖结构研究的前提，是生物活性和开发利用研究的关键[12-13]。目前，尚未有马卡列丙多糖研究的文献报道。基于此，本研究采用水提醇沉法和sevag法脱蛋白得到马卡列丙精多糖，并采用柱前衍生化法结合高效液相色谱法，分析了侗药马卡列丙多糖中单糖的组成及其摩尔比。

1 仪器与试药

1.1 药材

马卡列丙购自云南,经湖南医药学院汪冶教授鉴定为显脉旋覆花的根。

1.2 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪(含G1311B四元泵和G4212B二极管阵列检测器)，美国Agilent公司；AUW120D电子分析天平，日本岛津公司；Mighty-10超纯水机，上海砾鼎水处理设备有限公司。

1.3 药品与试剂

木糖，甘露糖，阿拉伯糖，葡萄糖均购自南京春秋生物有限公司；乙腈(色谱纯)，美国Tedia公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，阿拉丁试剂(上海)有限公司；实验用水由超纯水机制得；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 多糖的提取

取马卡列丙干燥粉末，精密称定10 g，加入500 mL纯水于70 ℃水浴锅中水浴回流1 h，提取3次，合并提取液进行减压浓缩。浓缩液加95%乙醇至含醇量达80%，4 ℃过夜后离心，收集沉淀，干燥即得粗多糖。将提得的粗多糖用纯化水溶解置分液漏斗中，加入Sevag试剂(三氯甲烷:正丁醇=4:1)除蛋白，Sevag试剂加入量为多糖溶液的1/4，充分振摇30 min后，经离心机离心1 min,收集水相，在水相中继续加入Sevag试剂除蛋白，重复上述操作4次，收集水相，加入95%乙醇至含醇量达80%，离心收集沉淀物，用无水乙醇、丙酮各洗3次，干燥，即得马卡列丙精多糖。

2.2 多糖的水解

精密称取上述马卡列丙精多糖50 mg，置于10 mL水解管中，加入2 mol/L硫酸溶液2 mL，于100 ℃干燥箱中水解8 h，用4 mol/L氢氧化钠溶液中和至pH约7.0，待衍生化。

2.3 对照品溶液的配制

称取阿拉伯糖、甘露糖、无水葡萄糖和木糖约20 mg，精密称定，置于10 mL的容量瓶中，用纯化水定容，分别配制为2.03 μg/μL，2.05 μg/μL，2.08 μg/μL，2.06 μg/μL的对照品溶液。

2.4 对照品和样品的衍生化

精密量取100 μL样品水解液、100 μL四种对照品混合溶液作为混标及100 μL纯化水置于不同的水解管中，分别加入100 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液及100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，混合后在 70 ℃水浴中反应30 min，取出冷却，加 100 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，再加水 1 mL，用1 mL氯仿萃取3次，弃去氯仿层，水层用0.45 μm微孔膜过滤后，进HPLC分析。

2.5 色谱条件

色谱柱:Thermo Scientieic BDS Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：0.5%磷酸盐缓冲液(A)和乙腈(B)梯度洗脱，见表1；流速：1.0 mL/min；检测波长245 nm；进样量：20 μL，柱温：45 ℃。

表1 流动相梯度洗脱比例表

2.6 方法学的考察

2.6.1 线性关系的考察

分别精密量取甘露糖，葡萄糖，阿拉伯糖和木糖对照溶液适量，配成一系列浓度的混合标准品溶液。按“2.4”项下衍生化后，按“2.5”项下的色谱条件依法测定，各化合物以质量为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性分析，计算相关系数，结果见表2。

表2 回归方程，线性关系和范围

2.6.2 精密度实验

精密吸取“2.3”项下混合对照品衍生溶液，连续进样6次，每次 20 μL，分别记录各成分峰面积并计算其RSD，测得甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖的RSD分别为 0.14%，0.05%，0.04%，0.09%，表明仪器的精密度良好。

2.6.3 重复性实验

取6份马卡列丙多糖，按“2.2”项水解，按“2.4”项进行衍生化，按“2.5”项下色谱条件，进行样品分析，测得甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖的含量，计算RSD分别为：3.84%，2.24%，1.16%，3.44%，表明该方法重复性良好。

2.6.4 稳定性实验

取“2.3”项中供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h进样，按色谱条件，记录峰面积，测得甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖的RSD分别为：0.32%，0.58%，0.50%，0.48%，表明样品在24 h内稳定。

2.6.5 加样回收率实验

表3 加样回收率

取已知含量的马卡列丙多糖样品约50 mg，精密称定，按“2.2”项方法水解，取100 μL水解液，平行6份，加入一定量的对照品溶液，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，测定并计算各成分的加样回收率以及RSD。结果甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖的平均加样回收率分别为98.7%，98.1%，96.3%，104.4%，RSD分别为3.07%，2.45%，2.81%，2.44%，表明该方法的准确度良好，结果见表3。

2.6.6 多糖样品组分分析和摩尔比

精密称取马卡列丙多糖，按“2.2”与“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.5”项下色谱条件，进HPLC分析，其色谱图如图1所示，结果表明马卡列丙多糖中含有甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖，其摩尔比值约为0.10:3.87:1.00:0.07。

图1 样品色谱图

3 讨论

3.1 多糖水解条件的考察

为了优化多糖的水解过程，本文对硫酸的用量(1, 2, 3 mL)，水解时间(7, 8, 9 h)和水解温度(90, 100, 110 ℃)，进行了单因素考察。结果表明，随着硫酸的用量增多、水解时间的增长、水解温度的提高，各单糖峰面积逐渐增加，在硫酸用量为2 mL，水解时间为8 h，水解温度为100 ℃时，各单糖的峰面积最大且稳定，与文献报道的水解条件基本一致[11]，因此最终选定在上述条件下进行多糖的水解。

3.2 色谱条件的选择

采用三种不同的色谱柱(Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)，Dikma Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Thermo Scientific Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，考察试样品的分离情况，结果表明Thermo Scientific Hypersil BDS C18对对照品和供试品溶液的分离效果较好。为了进一步优化色谱条件，分别对流动相的种类(甲醇/水和乙腈/水)，流速(0.8，1.0，1.2 mL/min)，柱温(25，30，35，40，45 ℃)以及梯度进行了考察，结果表明流速对色谱峰分离度影响不大，柱温可改善分离度，并降低柱压，因此最终，选择梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为45 ℃的色谱条件进行色谱分离。