内生链格孢菌纤维素酶辅助提取丹参茎叶中总丹酚酸条件优化

张 芮 刘水永恒 孙士妍 张可轩 汪 玉 田 园 史仁玖 常正尧 李艳玲

山东第一医科大学(山东省医学科学院)生命科学学院，山东 泰安 271016

丹参(Salviamiltiorrhiza)系唇形科鼠尾草属植物，富含丹参酮类、丹酚酸类、多糖类等资源性化学物质[1-3]，具有抗氧化、抗菌消炎、抗血栓、抗肿瘤等药理作用[4-7]。研究发现，丹参茎叶及花序中等传统非药用部位，含有丰富的水溶性丹酚酸类化学成分，其中丹酚酸B的含量较高[8]，对由于脂质的过氧化而引起的细胞膜损伤具有很明显的保护作用，还具有抗血小板聚集和防治强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)的作用[9]。以丹酚酸作为有效成分的药物已经成为研究和开发的热点，但目前提取丹酚酸多采用水提醇沉法[10-11]，得率最高只能达4.75%[10]。由于丹酚酸B不耐热，易氧化水解，对于受热温度和受热时间比较敏感，所以丹参的提取液不能够长时间高温浓缩。酶法水解丹参条件温和，克服了水提醇沉法因高温提取降低了丹酚酸类物质得率的缺点。

植物内生真菌(fungal endophyte)是一类寄生于健康活体植物组织中的特殊真菌，主要存在于表面细胞层下的组织中，是植物组织内的正常菌群，与宿主植物形成了互惠共生关系。研究发现，植物内生菌具有较高的木聚糖酶、果胶酶、纤维素酶和多酚氧化酶活性，具有降解部分植物木质素和纤维素的能力[12]。纤维素酶可快速分解细胞壁，反应温和，现已越来越多的应用于中药有效组分的提取[13]。本试验采用Box-Behnken响应面分析法进行试验设计，尽量避免复杂提取技术路线，其结果更适合于工业化提取，不仅为丹参茎叶中丹酚酸类物质的进一步开发提供理论指导，也为中药废弃物的再次利用提供一条新路。

1 材料和方法

1.1 材料

丹参茎叶于2017年8月采自山东第一医科大学(山东省医学科学院)药用植物园，自然阴干后在60℃烘箱中烘2 h，粉碎，过40目筛，分装备用。LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；V-5100型可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；FA2004N电子天平，日本津岛公司；ZHLY-180S型振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；SW-CJ-2F型超净工作台，江苏奥华仪器厂；DNP-9162BS-Ⅲ恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司。亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1种子及发酵培养基

PDA培养基：马铃薯200 g/L，琼脂20 g/L，葡萄糖20 g/L，蒸馏水定容至1000 mL，自然pH；刚果红纤维素培养基：微晶纤维素粉(CMC-Na)1.88 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，K2HPO40.5 g，刚果红0.2 g，琼脂14 g，(NH4)2SO42 g，明胶2 g，蒸馏水定容至1 000 mL；液体发酵培养基：KH2PO41.0 g，NaNO32.5 g，FeCl30.01 g，MgSO40.3 g，CaCl20.1 g，NaCl 0.1g，麸皮10 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2.2产纤维素酶菌株的筛选及粗酶液的制备

采用刚果红平板法[14]对产纤维素酶菌株进行初筛。将冰箱保存的菌种经PDA培养基活化后，转接到刚果红纤维素培养基平板上。用1 mg/mL刚果红溶液染色30 min后用蒸馏水清洗，最后用1 mol/L的NaCl溶液脱色30 min。选用游标卡尺，分别测量透明圈直径(H)和菌落直径(C)，选择两者(H/C)比值较大的菌株，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[15]，测定纤维素酶(CMC酶)酶活力进行复筛。采用打菌块的方法，将培养于固体平板3 d的菌种接种至液体发酵培养基中，每瓶100 mL培养基，两个6 mm菌块，于28℃、150 r/min培养5～7 d。培养完毕后，将液体发酵液于4 500 r/min的离心机中离心10 min后，取上清液，即为粗酶液。

1.2.3丹参茎叶中总丹酚酸的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝配位显色法[16]进行总丹酚酸含量测定。

1.2.3.1丹酚酸B标准曲线 丹酚酸对照品的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加蒸馏水定容至10 mL棕色量瓶中，用孔径为0.45 μm的微孔滤膜滤过，质量浓度为0.146 mg/mL的丹酚酸对照品溶液，分别从其中精密移取0、0.3、0.6、1.3、2.5、5 mL，加水定容至10 mL，精密移取稀释液2 mL，精密加入1% NaNO22. 5 mL，摇匀，暗处放置10 min后，再加入20% Al(NO3)30. 25 mL，摇匀，暗处放置10 min后，再精密加入1 mol/L NaOH 4 mL，摇匀，暗处放置15 min，最后于493 nm下测定其吸光度(A)，以吸光度值为纵坐标，丹酚酸B含量(X)为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3.2样品溶液测定 精密称取丹参药材粉末0.2 g，置于具塞锥形瓶中。精密加入水25 mL，称定质量，水浴回流30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，即得丹参供试品溶液。按标准曲线的制备项下方法于493 nm处测定吸光度值。

1.2.4酶法辅助提取总丹酚酸条件优化

考察酶液量、酶解pH以及酶解时间对丹参茎叶总丹酚酸提取效果的影响。在单因素试验的基础上，进行响应面法中的Box-Behnken 试验，利用Design-Expert设计三因素三水平试验，对丹参内生真菌Y-2纤维素酶提取总丹酚酸条件进行优化。

1.2.5统计学方法

采用SPSS19.0 软件进行数据分析，所有实验均重复3 次，利用Design-Expert 8.0.6程序对各个因素的响应值进行回归拟合分析。

2 结 果

2.1 纤维素酶产生菌的筛选结果

根据直径比值大小，用刚果红培养基透明圈法，从丹参茎叶中分离到了8株产纤维素酶的内生真菌菌株，其中Y-2具有较高纤维素分解能力。通过DNS法测定其纤维素酶活力，重复3次取得平均值，Y-2的CMC酶活力最高，达到46.63 U/mL。

2.2 内生真菌Y-2的形态鉴定结果

Y-2在PDA培养基上28℃培养7 d后，菌落呈黑色绒状，菌丝呈灰色至黑色，生长迅速，扩散快，绒毛状菌丝较为浓密(图1)。Y-2的光学显微镜镜检结果，如图2所示，分生孢子呈褐色，具分隔，为倒棍棒形。根据《真菌分类鉴定手册》初步确定为链格孢属(Alternariasp.)。

图1 内生真菌Y-2菌落特征

图2 Y-2光学显微镜下观察结果

2.3 单因素试验

2.3.1酶液量对丹参茎叶总丹酚酸提取的影响

将待测样品分别按照酶液量进行分组，每组样品酶液量分别为40、50、60、70、80、90 mL，同时设定酶解pH为6，温度为55 ℃，酶解时间6 h，并在以上设定好的条件下进行单因素试验。

图3 酶液量对丹参茎叶丹酚酸提取量的影响

由图3可知，总丹酚酸提取量随着酶液量的增加，丹酚酸的提取率也逐渐升高。当酶液量为90 mL时，丹参茎叶总丹酚酸提取率最高，但从80到90 mL增加不明显，考虑到经济因素选择最优酶液量为80 mL。

2.3.2酶解pH对总丹酚酸提取的影响

设定酶液量为80 mL，温度为55 ℃，酶解时间6 h，分别选取酶解pH为4、5、6、7、8，进行单因素试验，测定Y-2纤维素酶提取对丹酚酸含量的影响。

图4 pH对丹参茎叶丹酚酸提取量的影响

由图4可知，随着pH的不断增大，丹酚酸含量也在不断增加，当pH达到7时，丹酚酸含量达到最高值，随后在pH为8时，丹酚酸含量呈下降趋势。因此，选择pH 7作为提取丹酚酸的最适pH。

2.3.3酶解时间对丹酚酸提取的影响

将待测样品分别按照酶解时间进行分组，每组酶解时间分别为4、5、6、7、8 h，温度为55℃，酶解pH为7，并在以上设定好的条件下进行单因素试验。

图5 提取时间对丹参茎叶丹酚酸提取量的影响

由图5所示，随着酶解时间的不断增加，丹酚酸含量也在不断增加，当时间达到6 h时，丹酚酸含量达到最高值，随后酶解时间不断增大，丹酚酸含量呈下降趋势。

2.4 响应面法优化Y-2纤维素酶提取丹参茎叶总丹酚酸工艺条件

2.4.1Box-Benhnken实验设计与分析

实验因素及水平设计见表1，根据Box-Benhnken实验设计原理，并且结合单因素的实验结果，选取酶液量、酶解pH、酶解时间3个因素，以丹参内生真菌Y-2纤维素酶提取丹酚酸含量为响应值，来设计三因素三水平的响应面分析实验，并且利用Design-Expert 8.0.6软件对每个因素下所产生的一系列数据进行二次回归拟合，然后得到纤维素酶提取丹酚酸含量(Y)对3个因素的二次多项回归方程，再由所得到的二次方程来进一步取得最佳的提取条件。

通过Design-Expert 8.0.6对表1中响应面与各个因素进行回归拟合，得到纤维素酶提取丹酚酸含量对3个因素酶液量(A)、酶解pH(B)、酶解时间(C)编码值的二次多项回归方程为Y=3.60-0.12A+0.18B-0.046C-0.015AB+0.038AC+0.10BC-0.35A2-0.74B2-0.56C2。实验结果如表2所示。

表2 Box-Behnken中心组合设计方案及实验结果

利用Design-Expert 8.0.6程序对各个因素的响应值进行回归拟合分析，所得到的回归模型的各项系数的显著性检验结果和方程的方差分析结果。从表3可以看出，整体模型达极显著水平，即P值小于0.01，模型的失拟项(P=0.103 50)无统计学意义；相关系数R2= 0.925 7，说明该方程对实验拟合较好，模型建立的回归方程能代替真实点解释响应结果。

在表3中，B2、C2的P值均远小于0.01，有统计学意义，A2的P值显著性次之。3个因素对纤维素酶提取丹酚酸含量的影响强弱依次排序为：B>C>A，即酶解pH>酶解时间>酶液量。

2.4.2因素间交互影响

根据回归模型作出相应的响应面和等高线(图6至8)，用来考察拟合响应面的形状并分析各因素对于响应值的影响，还有他们之间的相互作用，并且从中确定最佳因素的水平范围。根据研究显示，等高线的形状反映了交互效应的强弱，若等高线越趋向于椭圆，则表明交互作用越强，反之，若等高线越趋向圆则表明因素之间的交互作用越弱。响应曲面的倾斜度越高，且等高线越密集，则说明两因素之间的交互作用越明显。通过比较两组图响应面最高点以及等高线，可以看出，在所选范围内存在着极值，也就是响应面最高点同时也是等高线最小椭圆的中心点。

根据图6，可以看出第一个图中，响应面的等高线为椭圆形，并且坡度比较陡，说明了酶液量与酶解pH的交互作用较强，二者对于丹酚酸的提取影响较大；同时也可以看出，酶解pH所对应的曲面相对于酶液量的曲面而言较陡，说明酶解pH对丹参中单酚酸提取的影响力相对于酶液量的影响来说，要更大一些。

图6 酶液量与酶解pH对丹酚酸提取量的影响

由图 7可知，响应面的等高线为椭圆形，并且坡度相对较强，说明酶解时间与酶液量的交互作用强，对于丹酚酸的提取率影响较大；同时酶解时间对应的曲面相对于酶液量而言较陡，说明酶解时间对丹参中单酚酸提取的影响要大于 酶液量的影响。

图7 酶液量与酶解时间对丹酚酸提取量的影响

图8 酶解pH与酶解时间对丹酚酸提取量的影响

由图7，8可知，响应面等高线的形状为近似圆形的椭圆，且坡度较缓，这说明酶解pH与酶解时间的交互作用较弱，对于丹酚酸的提取影响较小；同时酶解pH对应的曲面相对于酶解时间而言较陡，说明酶解pH对丹酚酸提取的影响力相对于酶解时间的影响要大一些。

综上所述，各因素间的交互作用的响应值影响情况，其中酶解pH的影响效应最为显著，其次是酶解时间，酶液量对丹酚酸提取的影响最小。

经过Design Expert 8.0.6软件的分析，可知丹参中丹酚酸酶解的最佳工艺条件为：酶解时间6 h，酶解温度55℃，纤维素酶用量80 mL、酶解pH 7。在此条件下，丹酚酸理论提取量与实验结果所得接近。在最优的提取条件下，丹参茎叶总丹酚酸的得率比较高，并且优于单因素试验设计。最后得到各因素变量的二次方程模型，可以看出，该模型回归比较显著，对试验拟合较好，有一定的应用价值。

3 讨 论

丹酚酸是丹参提取物中的有效成分，具有较强的清除人体内的氧自由基，抑制脂质的过氧化反应，并且能够提高人体的免疫力，对一些疾病具有较好的治疗以及防御能力[17-19]。本研究从丹参茎叶中分离出一株高产纤维素酶的菌株Y-2，结合该菌株的菌落形态、孢子形态等特征，鉴定为链格孢属(Alternariasp.)，该菌株的CMC酶活力达到46.63 U/mL，这与已分离到的内生菌产纤维素酶菌株相比，有较高纤维素酶活性[20]，为该内生菌的进一步研究应用奠定了基础。

纤维素酶可快速分解细胞壁，反应温和，现已越来越多的应用于中药有效组分的提取研究中[21-22]。Box-Behnken 响应面分析法较传统优化方法更为精确可靠[22-24]，本试验采用响应面法进行试验设计，尽量避免复杂提取技术路线，其结果更适合于指导扩大提取，为丹酚酸类化合物的进一步开发提供理论指导。