棘孢木霉T-6对烟草促生及对黑胫病和根黑腐病的抗病作用

宋玉娟 韩雪莲 张安盛 王玉军 高克祥 梁元存

摘  要：利用生防菌防治土传病害是植物病害防治中的重要措施，在温室盆栽条件下研究了棘孢木霉T-6对烟草促生和抗病效果。结果表明，棘孢木霉T-6对烟草黑胫病菌、烟草根黑腐病菌的菌丝生长抑制率分别达49.62%、59.23%;温室盆栽条件下，棘孢木霉T-6对黑胫病和根黑腐病的防治效果分别达到74.45%和75.14%。棘孢木霉T-6处理后提高了烟草叶片叶绿素含量、类胡萝卜素含量和超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的活性，棘孢木霉T-6处理的烟株生长状况明显好于对照。棘孢木霉T-6能够促进烟株生长和提高烟草对黑胫病和根黑腐病的抗性，具有良好的应用潜力。

关键词：烟草;棘孢木霉T-6;黑胫病;根黑腐病;生物防治

Effects of Trichoderma asperellum T-6 on Growth Promotion， Control of Black Shank and Black Root Rot in Tobacco

SONG Yujuan¹， HAN Xuelian¹， ZHANG Ansheng²， WANG Yujun¹， GAO Kexiang¹， LIANG Yuancun^1*

（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian， Shandong 271018， China; 2. Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan， 250100， China）

Abstract： UsingTrichodermaspp. to control plant soil-borne diseases is a promising field in biological control. In order to investigate the effect ofT. asperellumT-6 on tobacco growth and resistance to soil-borne fungi， spore suspensions ofT. asperellum T-6 were inoculated into soil， and then pot experiments were conducted in greenhouse. The results showed that hyphal growth ofPhytophthora parasiticaandThielaviopsis basicolawas inhibited byT. asperellumT-6， and the inhibited rates were 49.62% and 59.23%， respectively. Control efficiency ofT. asperellumT-6 on black shank and black root rot reached 74.45% and 75.14%. AfterT. asperellumT-6 pretreatment， the content of chlorophyll and carotenoids and the activities of three resistance-related enzymes in tobacco leaves were increased， and the growth of tobacco treated withT. asperellumT-6 were better than control. Taken together， the results from this study indicated thatT. asperellum T-6 could control tobacco black shank and black root rot effectively， and promote tobacco growth.

Keywords： tobacco;Trichoderma asperellum; black shank; black root rot; biological control

煙草黑胫病是烟草寄生疫霉（Phytophthora parasitica）引起的菌物性土传病害，造成的年均损失约为12 303.3万元^[1-2]。烟草根黑腐病是由基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）引起的真菌性土传病害，在我国各烟区均有发生，严重地块发病率可达30%以上^[3]。近年来，由于烟草种植面积的调整，耕作制度及烟草品种的变化，烟草黑胫病和根黑腐病有加重趋势^[1]。我国主要采用甲霜灵等化学农药来防治黑胫病和根黑腐病，长期使用化学农药容易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降^[4]和环境污染。

生物防治是烟草病害防治中的重要方法之一。目前，已经发现多种具有防治烟草黑胫病和根黑腐病的生防菌。例如绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）对烟草疫霉游动孢子的释放抑制率达52.24 %，對烟草黑胫病的盆栽防效达96.29%^[5]。拮抗放线菌吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）能够抑制烟草根黑腐病病原菌菌丝的生长，它的无菌滤液能够抑制孢子萌发，即使孢子萌发，芽管也会畸形^[6]。本试验在温室条件下研究棘孢木霉T-6 对烟草生长发育的影响，探讨其对烟草抗病性的诱导作用，旨在为进一步开发木霉制剂提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  供试生防菌和病原菌  棘孢木霉（Trichoderma asperellum） T-6及烟草黑胫病菌和根黑腐病菌由本实验室保存。

1.1.2  供试烟草品种  云烟87。

1.1.3  供试培养基  PDA 培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水定容至1000 mL）;燕麦培养基（燕麦30 g，琼脂粉17 g，蒸馏水定容至1000 mL）。

1.2  试验地点和方法

1.2.1  试验地点  本试验于2017—2018年在山东农业大学真菌和真菌病害实验室进行。

1.2.2  PDA平板对峙拮抗试验  黑胫病菌丝块（直径5 mm）接种至距培养皿平板（直径9 cm）距中心2 cm处，25 ℃培养1 d后，在培养皿平板另一侧距中心2 cm 处接种棘孢木霉T-6，以空白琼脂块为对照，28 ℃培养3 d后，测量黑胫病菌菌落直径并计算抑菌率。抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。根黑腐病菌的对峙培养同上。

1.2.3  孢子悬浮液的制备  棘孢木霉T-6活化后在PDA平板上培养7 d，用无菌水洗脱孢子配制成浓度为1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹spores/mL的孢子悬浮液。黑胫病菌产孢采用梁元存等^[7]的方法，制备成浓度为1×10⁵spores/mL游动孢子悬浮液。根黑腐病菌活化后在PDA平板上培养10 d，用无菌水洗脱孢子配制成浓度为2×10⁵spores/mL的孢子悬浮液。

1.2.4  棘孢木霉对烟草的促生作用  分别设定1×10⁷、1×10⁸和1×10⁹spores/mL的棘孢木霉T-6孢子悬浮液处理，每株烟草灌根接种20 mL孢子悬浮液（塑料盆内径12 cm，高度10 cm）。以20 mL无菌水为对照。木霉处理60 d后，取出烟株用清水洗净根部，自然条件下风干后测量烟株鲜质量、根长、茎粗、最大叶长、最大叶宽，将烟株放置于烘箱中105 ℃杀青30 min，60 ℃继续烘干48 h，取出测量整株干质量。每处理15株，重复3次。

1.2.5  棘孢木霉对黑胫病和根黑腐病防治效果  从育苗盘中选择长势一致苗龄60 d的烟苗移栽，缓苗一周。处理组：每株烟草灌根接种20 mL 1×10⁸spores/mL棘孢木霉T-6孢子悬浮液，2 d后，再接种5 mL的1×10⁵spores/mL烟草黑胫病菌游动孢子悬浮液或5 mL的1×10⁵spores/mL烟草根黑腐病菌孢子悬浮液。对照组：不接种棘孢木霉T-6孢子悬浮液，只接种5 mL的1×10⁵spores/mL烟草黑胫病菌游动孢子悬浮液或5 mL的1×10⁵spores/mL烟草根黑腐病菌孢子悬浮液。每处理15株，重复3次。接种病原菌2周后，按照文献[1]调查各处理烟株的发病情况，计算病情指数和相对防效。

1.2.6  烟草根系活力的测定  根系活力的测定参考白宝璋等^[8]的方法。

1.2.7  烟草叶片生理指标的测定  烟株用浓度为1×10⁸spores/mL的棘孢木霉T-6孢子悬浮液灌根处理后，在2、4、6、8、10、12 d时，各处理取从上至下数第4片展开的叶片，液氮速冻后研磨混匀，测定的生理指标和方法包括：叶绿素含量的测定参考李合生^[9]的方法，过氧化物酶（peroxidase，POD）的活性测定参考张龙翔^[10]的方法，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性测定参考高俊凤^[11]的方法，过氧化氢酶（catalase，CAT）的活性测定参考刘萍等^[12]的方法。

1.2.8  数据统计  采用 DPS软件，Duncan新复极差法，在0.05水平上分析差异显著性。

2  结  果

2.1  棘孢木霉T-6对黑胫病菌和烟草根黑腐病菌的拮抗作用

对峙培养3 d后，棘孢木霉T-6对烟草黑胫病菌、烟草根黑腐病菌的抑制率分别达49.62%、59.23%，对照组和处理组病原菌的菌落半径差异显著（表1）。

处理组病原菌菌落边缘的菌丝稀疏、长势减弱，而对照病原菌生长正常，呈圆形向四周扩展。继续培养7 d后观察到病原菌的菌落被棘孢木霉T-6吞噬覆盖，说明棘孢木霉T-6能够重寄生2种病原菌（图1）。

2.2  棘孢木霉T-6對烟株生长发育的影响

从表2可以看出，经棘孢木霉T-6处理后，烟草的根长、株高、鲜质量、干质量均有明显增加，而茎粗、最大叶长、最大叶宽没有显著变化。其中浓度为1×10⁸spores/mL和1×10⁹spores/mL时比浓度为1×10⁷spores/mL的促生效果好，但两者之间差异不显著，因此从经济的角度来看，使用浓度为1×10⁸spores/mL的棘孢木霉T-6孢子悬浮液更适合。此时，它的根长增加了58.14%，株高增加了45.37%，干质量增加了67.65%，鲜质量增加了77.44%。以上结果表明棘孢木霉T-6能有效改善烟草的农艺性状，提高生物量。

2.3  棘孢木霉T-6对烟草黑胫病的防治效果

如表3所示，接种棘孢木霉T-6后病情指数为16.08，对照组的病情指数为62.94，防治效果达到了74.45%。经棘孢木霉T-6处理的烟苗，接种黑胫病菌后植株发病明显推迟，发病程度较轻，植株生长发育正常。而对照烟苗发病严重，植株生长受到严重影响，叶片变黄枯萎（图2）。以上结果说明棘孢木霉T-6可以增强烟草植株对黑胫病的抗病能力。

2.4  棘孢木霉T-6对烟草根黑腐病的防治效果

如表4所示，经棘孢木霉T-6处理的烟株发病较轻，其病情指数为13.71，显著低于对照组55.14，对照植株生长受到严重影响（图3），根系大多坏死且呈黑色。防治效果达到了75.14%。以上结果说明棘孢木霉T-6可以提高烟草对根黑腐病的抗病能力。

2.5  棘孢木霉T-6对烟草根系活力、叶绿素和类胡萝卜素含量的影响

从图4A可以看出，在棘孢木霉T-6处理2、4、6、8、10、12 d后，烟草根系活力分别高出对照组的68.63%、50.82%、59.26%、53.45%、22.81%、1.70%。图4B表明，处理组的叶绿素含量与对照组差异显著，在棘孢木霉T-6处理2、4、6、8、10、12 d后，处理组的叶绿素含量分别高出对照组的9.58%、31.5%、50.63%、43.56%、27.9%、32.49%。图4C表明，处理组的类胡萝卜素含量与对照相比差异显著，在处理2、4、6、8、10、12 d后，处理组的类胡萝卜素含量分别高出对照组3.27%、44.44%、47.17%、35.23%、57.46%、45.26%。以上结果均表明，棘孢木霉T-6能够提高烟草根系活力，增加烟草叶片叶绿素和类胡萝卜素的含量。

2.6  棘孢木霉T-6对烟草叶片中POD、SOD、CAT酶活性的影响

图5显示，接种棘孢木霉T-6的烟草叶片酶活性要高于对照，其中在接种棘孢木霉T-6 4 d时，3种酶活性达到最大值，此时处理烟株叶片的POD、SOD、CAT酶活性分别比对照高出47.26%、27.52%、46.78%，在测定的12 d内，棘孢木霉处理的烟草3种酶活性均比对照高。这些结果表明棘孢木霉T-6能够提高烟草体内防御酶的活性。

3  讨  论

目前，国内外有关木霉对植物病原菌物病害的防治已有很多报道，但棘孢木霉菌在烟草上的生防研究较少。本试验发现棘孢木霉T-6对烟草黑胫病的防治效果达到75.18%，对烟草根黑腐病的防治效果达到76.94%。说明棘孢木霉T-6可以增强烟草植株对黑胫病、根黑腐病的抗病能力。棘孢木霉T-6生长速度快，可较快占据营养空间，而且对两种病原菌都具有一定的抑菌和重寄生作用，这是棘孢木霉T-6参与抗病的生防机制。

有研究发现棘孢木霉T437能够促进黄瓜根系的生长^[13]。一些生防细菌如地衣芽孢杆菌W10对烟草根长、株高、鲜质量都有明显的促生作用^[14]。本试验发现，经过棘孢木霉T-6处理后，根长、株高、鲜质量、干质量都有显著的增加。木霉菌株能和植物建立共生关系，通过穿透植物的表皮在植物根系定殖并且产生刺激植物生长和诱导植物防御反应的化合物。

叶绿素和类胡萝卜素是是衡量植物光合作用能力的重要指标，对植物的生长起决定性作用。根系能够吸收无机盐和水分，并且合成一些重要的物质，它是植物的重要器官之一。有研究表明短芽孢杆菌DZQ3处理烟株后，烟草体内的叶绿素含量比对照高出17.03%，烟草的根系活力高出对照38.34%，并且显著促进烟草的生长发育^[15]。吴秉奇等^[16]发现烟草根际拮抗菌多粘类芽孢杆菌处理烟草后，烟草体内的叶绿素含量比对照高出14.97%，根系活力比对照高出13.13%，烟草的农艺性状和生物量都有显著增加。本试验表明，经过棘孢木霉T-6处理后，烟草体内的叶绿素含量、类胡萝卜素含量和根系活力均显著高于对照组，最终提高烟草的光合速率，加快碳水化合物的合成以满足烟草生长的需要，根系活力的提高有利于烟草根系吸收土壤养分，促进烟草的生长。这也是棘孢木霉T-6对烟草的促生长机制之一。

研究表明，生物因子和非生物因子等多种诱导因子可诱导植物系统抗性^[17-18]，导致植物体内SOD、POD、CAT等防御酶活性的升高。POD是植物体内的一种重要的防御酶，参与合成木质素，能够催化酚类的氧化。SOD和CAT与植物体内活性氧的清除密切相关^[19]。张良等^[20]发现长柄木霉和泾阳链霉菌复配能够显著增加烟草体内SOD、POD、CAT的活性。FUCHS^[21]研究表明生防菌能使植株产生应激反应，诱导植物抗性的产生。本试验研究表明，棘孢木霉T-6能够显著提高烟草叶片中POD、SOD、CAT的活性。其中处理组的POD、SOD、CAT的酶活性均在第4天时出现了峰值，并且酶活性一直高于对照组。这些结果表明棘孢木霉T-6可提高烟草抗病相关的酶活性，从而合成更多的抗病相关产物，增强烟草对病害的抵抗力。

4  结  论

本试验结果表明，棘孢木霉T-6能提高烟草对黑胫病和根黑腐病两种土传菌物病害的抗性和抗病相关防御酶活性，并对烟草有较好的促生作用。但本文试验仅为温室盆栽结果，关于棘孢木霉T-6田间应用效果还有待进一步研究。

参考文献

1. 陈瑞泰，朱贤朝，王智发，等. 全国16个主产烟省（区）烟草侵染性病害调研报告[J]. 中国烟草科学，1997（4）：1-7.

CHEN R T， ZHU X C， WANG Z F， et al. Report of investigating and studying tobacco infectious diseases of 16 main tobacco producing provinces （regions） in China[J]. Chinese Tobacco Science， 1997（4）： 1-7.

1. 王志愿，姜清治，霍沁建，等. 烟草黑胫病的研究进展[J]. 中国农学通报，2010，26（21）：250-255.

WANG Z Y， JIANG Q Z， HUO Q J， et al. Progress of research on tobacco black shank[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2010， 26（21）： 250-255.

1. 朱贤朝，王彦亭，王智发. 中国烟草病害[M]. 北京：中国农业出

版社，2002.

ZHU X C， WANG Y T， WANG Z F. Tobacco diseases of china[M]. Beijing： China Agriculture Press， 2002.

1. 王革，郑小波，陆家云，等.云南省烟草黑胫病菌对甲霜灵抗性的检测[J].南京农业大学学报，1997，20（4）：105-107.

WANG G， ZHENG X B， LU J Y， et al. Detection of resistance of black shank tometalaxyl in yunnan province[J]. Journal of Nanjing Agricultural University， 1997， 20（4）： 105-107.

1. 王晶晶，蔣士君，常淑娴，等. 两株生防菌对烟草黑胫病的抑制活性及其鉴定[J]. 中国烟草学报，2011，17（6）：89-93.

WANG J J， JIANG S J， CHANG S X， et al. Antifungal activity of two biocontrol strains against tobacco black shank and their identification[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2011， 17（6）： 89-93.

1. 易龙，肖崇刚，马冠华，等. 拮抗放线菌TA21对烟草根黑腐病菌的抑制及其控病作用[J]. 中国生物防治，2010，26（2）：186-192.

YI L， XIAO C G， MA G H， et al. Biocontrol effect and inhibition activity of antagonistic actinomycetes strain TA21 againstThielaviopsis basicola[J]. Chinese Journal of Biological Control， 2010， 26（2）： 186-192.

1. 梁元存，刘延荣，王玉军，等. 烟草黑胫病菌致病性分化和烟草品种的抗病性差异[J]. 植物保护学报，2003，30（2）：143-147.

LIANG Y C， LIU Y R， WANG Y J， et al. Pathogenicity differentiation ofPhytophthora parasiticaand the disease resistance difference of tobacco against black shank[J]. Acta Phytophylacica Sinica， 2003， 30（2）： 143-147.

1. 白宝璋，金锦子，白崧. 玉米根系活力TTC测定法的改良[J]. 玉米科学，1994，2（4）：44-47.

BAI B Z， JIN J Z， BAI S. Improvement of TTC method determining root activity in corn[J]. Maize Science， 1994，2（4）： 44-47.

1. 李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

LI H S. Principles and techniques of plant physiological and biochemical experiments[M]. Beijing： Higher Education Press， 2000

1. 张龙翔. 生化试验方法和技术[M]. 1版. 北京：高等教育出版社，1997.