福白菊总黄酮的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化活性研究

田明杰，谭宏渊，叶帆宇，周劲杰，胡 婷，占剑峰，王蔚新，向 福，李士明，吴 鹏

（黄冈师范学院 生物与农业资源学院 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄冈 438000）

福白菊（Chrysanthemum morifolium）是以湖北麻城福田河镇为中心、大别山地区种植的地方菊花品种，培育历史悠久，具有朵大肉厚、花瓣玉白、汤液清澈等品质特征。麻城福白菊主要含有黄酮类、挥发油类、有机酸类等化学成分，具有抑菌、抗氧化、抗衰老等药理作用[1]。麻城福白菊中含有丰富的黄酮，达8.19%[2]，为药食兼用型中药材[3]，但目前对麻城福白菊的研究主要集中在栽培技术、初级产品加工等方面，而对其功能性分析及深加工方面的研究鲜有报道。

目前，提取菊花中黄酮的方法主要有有机溶剂提取法、微波辅助萃取、超声波提取法等。LIU Y H等[4]利用超声波提取技术对菊花中黄酮进行提取，最优条件下总黄酮提取率为5.24%，但耗时30 min。陈婷[5]采用乙醇提取法，优选菊花进行总黄酮的提取，最优提取工艺下，总黄酮的浸提量为28.11 mg/g。微波辅助萃取技术是在有机溶剂浸提的同时加入微波，与前两者相比，具有操作时间短，有效成分收率高等特点[6]，近年来广泛用于天然产物的提取。杨浩等[7]利用微波辅助萃取法提取菊花中总黄酮，最优提取工艺为乙醇体积分数70%，时间为100 s，料液比为1∶20（g∶mL），此时提取率为8.97%。

为进一步挖掘麻城福白菊的综合利用价值，本研究以麻城福白菊为原料，采用微波辅助乙醇进行提取的方法，通过单因素及响应面试验设计[8]对总黄酮的提取工艺条件进行了优化，确定其最佳提取工艺条件，并测定了福白菊总黄酮的还原能力以及对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除率，以此对其抗氧化活性进行探究，旨在为麻城福白菊总黄酮的深加工及合理开发提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麻城福白菊：湖北新奇益科技有限公司；芦丁标准品（纯度＞98%）：中国药品生物制品检定所；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、DPPH、磷酸盐、铁氰化钾、三氯乙酸、抗坏血酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DFT-200C 高速万能粉碎机：上海比朗仪器制造有限公司；WBFY-201微波化学反应器：巩义市予华仪器有限责任公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；723型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；H/T18MM台式高速离心机：湖南赫西仪器装备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麻城福白菊总黄酮的提取工艺流程

麻城福白菊→粉碎成粉→过80目筛→称质量→按1∶40（g∶mL）的料液比加入体积分数为70%乙醇→设置微波功率240 W，微波提取时间2 min（20 s微波一次，分六次微波）条件下进行微波辅助提取→真空抽滤（真空度为0.04 MPa）→总黄酮粗提液

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制及总黄酮含量测定[9-11]

以吸光度值A（y）为纵坐标，芦丁质量浓度（x）为横坐标，绘制芦丁标准曲线，得标准曲线回归方程y=0.1547x+0.0059，相关系数R2=0.999 2。按照回归方程计算样品中总黄酮含量。福白菊总黄酮得率计算公式[12]如下：

式中：X为福白菊中总黄酮的提取率，%；c为总黄酮的质量浓度，g/L；V为样品溶液体积，mL；n为稀释倍数；m为麻城福白菊粉末的质量，g。

1.3.3 提取条件优化单因素试验[13-14]

准确称取1.00 g麻城福白菊粉末，分别在不同微波提取时间（5 s、30 s、60 s、90 s、120 s）、不同料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL））、不同微波功率（80 W、240 W、400 W、640 W、800 W）条件下进行提取，分别考察提取时间、料液比、微波功率对麻城福白菊总黄酮得率的影响。

1.3.4 提取条件优化响应面优化试验设计

根据单因素试验结果，以料液比（A）、微波功率（B）、微波提取时间（C）3个因素为自变量，总黄酮得率（Y）为响应值，利用Box-Behnken design法设计3因素3水平的试验，试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 抗氧化活性研究

（1）DPPH自由基清除能力的测定

参照腾昭玉等[15-17]的方法并加以修改。配制福白菊总黄酮溶液质量浓度分别为0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L，以相同质量浓度的维生素C溶液为对照，分别准确移取2 mL样品溶液与2 mL 0.15 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液于试管中混匀，避光静置30 min，以无水乙醇作为参比液在波长517 nm处测定吸光度值，记为Ax；同时以2 mL无水乙醇替代样品溶液，测定吸光度值Ao。以及2 mL等浓度的待测样品与等体积无水乙醇混合，测定其本底吸光度值Axo。DPPH自由基清除率（Y）计算公式如下：

（2）还原能力的测定[18]

分别吸取2.5 mL不同浓度的样品，依次加入0.2 mol/mL磷酸盐缓冲液（pH 6.6）2.5 mL和1%K3Fe（CN）62.5 mL，混合均匀，放置于50 ℃恒温水浴中反应20 min后取出，急速冷却，再加入10%三氯乙酸2.5 mL并于3 000 r/min条件下离心10 min。取上清液5.0 mL，加入5.0 mL蒸馏水和1.0 mL 1 mg/L FeCl3，混匀后静置10 min，在波长700 nm处测定吸光度值A，同时蒸馏水替代样品，测定空白组的吸光度值A0，再得出还原力。ΔA越大，反映出还原能力越强，抗氧化性也就越强。还原力计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 提取条件优化单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比对总黄酮得率的影响

图1 料液比对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of material to liquid ratio on the yield of total flavonoids

如图1所示，当料液比为1∶20～1∶40（g∶mL）时，总黄酮的得率随料液比的减小而增加；在料液比为1∶40（g∶mL）时，总黄酮的得率达到峰值为6.18%；料液比为1∶40～1∶60（g∶mL）时，总黄酮得率减小。这是因为，随着料液比的变化，即提取单位质量福白菊中总黄酮所用的溶剂量在增加，福白菊溶剂体系的总黄酮平衡浓度变小，更多总黄酮溶解于溶剂中，得率不断上升，而随着料液比的增加，单位时间内，物料温度降低，细胞结构破坏不够，从而影响总黄酮得率[19]。因此，最适料液比为1∶40（g∶mL）。

2.1.2 微波功率对总黄酮得率的影响

图2 微波功率对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of microwave power on the yield of total flavonoids

如图2所示，随微波功率在80～240 W增加时，总黄酮的得率随之增大；微波功率为240 W时，总黄酮的得率达到最高，为6.07%；随微波功率在240～800 W范围内增加，总黄酮得率逐渐下降。这是因为随着微波功率的提高，促使分子进行无规则运动，使其运动速率增加，随之物质渗透、扩散和溶解速度加快，溶解的总黄酮的含量增加；但当微波功率＞240 W之后，随着微波功率的增大，温度升高，使乙醇的挥发加快，影响试验效果；此外微波功率过高，导致提取液乙醇的温度过高，破坏了黄酮类化合物的结构，从而影响总黄酮的得率[20-21]。因此，最适微波功率为240 W。

2.1.3 微波提取时间对黄酮得率的影响

图3 微波辅助提取时间对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of microwave-assisted extraction time on the yield of total flavonoids

如图3所示，微波提取时间在5～60 s内，总黄酮的得率随之呈上升趋势；微波时间为60 s时，总黄酮得率最大，为6.21%；微波提取时间＞60 s之后，总黄酮的得率随之下降这是由于微波提取时间过长，微波辐射使黄酮降解，从而破坏黄酮类化合物的结构，影响总黄酮得率。此外，提取液的温度过高，乙醇蒸发严重[22]，导致总黄酮得率下降。因此，最适微波提取时间为60 s。

2.2 提取条件优化响应面试验结果及分析

2.2.1 Box-Behnken试验设计结果

根据单因素试验结果，以料液比（A）、微波功率（B）、微波提取时间（C）为影响因素，得率（Y）为响应值，利用Box-Behnken法设计优化试验，响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.2 回归模型的建立与分析[23]

通过Design-Expert分析软件对表2结果进行回归拟合分析，得到总黄酮得率对料液比、微波功率、微波时间的二次回归方程：

响应面回归模型的方差分析及显著性检验结果如表3所示。由表3可知，回归模型中P＜0.000 1，说明回归模型极显著，失拟项P=0.465 9＞0.05，说明影响不显著，该方程合理可行，且决定系数R2=0.939 2，校正决定系数R2Adj=0.982 4，表明这个回归模型可以解释98.24%的响应值的变化，回归方程对试验的拟合性比较好，所以用此模型和方程来探究提取福白菊中总黄酮的最适条件是可行的。交互项BC、二次项B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），二次项A2对结果影响显著（P＜0.05）。

通过比较F值的大小可得，料液比、微波提取时间、微波功率三者对福白菊总黄酮得率的影响由大到小为微波功率（B）＞料液比（A）＞微波提取时间（C）。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 响应面分析及验证[24]

料液比、微波功率与微波提取时间3个因素之间的交互作用对麻城福白菊总黄酮得率影响的响应面及等高线如图4所示。

从图4a可以看出，三维图较平缓，说明微波功率和料液比两个因素对总黄酮得率的影响较为接近，两因素的交互作用不显著[25]（P＞0.05）。从图4b可以看出，三维图较平缓，说明微波时间和料液比两个因素的交互作用不显著（P＞0.05）。从图4c可以看出，三维图较陡，且从其等高线图可以看出，等高线为较扁的椭圆形，说明微波功率和微波时间两个因素对福白菊总黄酮的得率影响极显著（P＜0.05）。综合分析发现，微波功率和微波时间两个因素对福白菊总黄酮的得率影响的交互作用最为显著。

利用软件Design-Expert 8.0优化模型，得到的最佳工艺条件为：微波功率266.44 W、料液比1∶41.36（g∶mL）、微波提取时间58.47 s，总黄酮的得率预测值为7.20%。考虑到实际操作的方便性和可行性，修正提取工艺条件为微波功率240 W、料液比1∶40（g∶mL）、微波提取时间60 s，此条件下进行试验3次取平均值，得到总黄酮得率实际值为7.18%，与模型预测的理论值相差0.02%，证明该模型预测结果有效可靠。

图4 微波功率、微波提取时间及料液比交互作用对福白菊中总黄酮得率影响的响应面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between microwave power,extraction time and material to liquid ratio on total flavonoids yield from Chrysanthemum morifolium

2.3 抗氧化活性试验结果与分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力的测定结果

图5 福白菊总黄酮对DPPH自由基清除率测定结果Fig.5 Determination results of DPPH free radical scavenging rate of total flavonoids from Chrysanthemum morifolium

如图5可知，福白菊中总黄酮在质量浓度0.1～0.5 g/L范围内，对DPPH自由基有较好的清除能力，且随总黄酮质量浓度的增大其清除能力逐渐增强，当总黄酮质量浓度为0.5 g/L时，清除率达到最高，为77%。福白菊中总黄酮的DPPH自由基清除率均低于维生素C。

2.3.2 还原能力的测定结果

由图6可以看出，不同质量浓度的福白菊总黄酮均表现出一定的还原能力，且还原力随其质量浓度的增大而增强。总黄酮质量浓度在0.002 g/L、0.006 g/L、0.008 g/L时，其还原能力高于维生素C，而总黄酮质量浓度在0.004 g/L、0.010 g/L时，福白菊中总黄酮的还原能力略低于VC，因此，可以得出结论，福白菊中的总黄酮具有较好的抗氧化能力。

图6 福白菊总黄酮总还原能力测定结果Fig.6 Determination results of total reduction ability of total flavonoids from Chrysanthemum morifolium

3 结论

以福白菊为原料，福白菊中总黄酮的得率为指标，在单因素的实验基础上，利用响应面优化分析，得出微波辅助提取福白菊总黄酮的最优工艺为微波功率400 W，微波提取时间60 s，料液比1∶40（g∶mL）。在此优化条件下，福白菊总黄酮得率为7.31%。本研究优化了微波辅助提取福白菊总黄酮的工艺条件，以期为福白菊中总黄酮的研究提供参考数据。

体外抗氧化活性研究表明，随着福白菊总黄酮质量浓度的增大，其对DPPH自由基的清除能力逐渐增强，在质量浓度为0.50 g/L时最强，为77%；当质量浓度为0.010 g/L时，还原能力最高，表现出了较好的抗氧化活性。以上结果，为深入开发福白菊中总黄酮资源，提供了重要的理论依据。