蜜环菌发酵液对睡眠剥夺小鼠行为学及氧化应激水平的影响

吕瑞娜万茜淋田风华贾传文李长田∗

（1.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春130118； 2.长春中医药大学，吉林 长春130117）

蜜环菌Armillaria mellea（Vahl）P.Kumm.分类上隶属于真菌界（Fungi）、担子菌门（Basidiomycota）、蘑菇纲（Agaricomycetes）、蘑菇目（Agaricales）、泡头菌科（Physalacriaceae）、蜜环菌属（Armillaria）［1］，是一种药食兼用菌，其与传统中药天麻存在着微妙的共生关系，大量研究表明，蜜环菌及其发酵产物与天麻存在着许多相似的药理作用［2］。现代研究表明，蜜环菌及其发酵产物具有很好的调节中枢神经系统的功效，包括镇静安神、抗惊厥、抗老年痴呆、保护缺血性脑组织等［3-4］。随着蜜环菌发酵工艺的成熟及其药理活性的深入研究，相继开发出了以蜜环菌发酵产物为主的多种脑保健制剂，包括蜜环菌糖浆、健脑露、蜜环菌浸片、脑心舒口服液等［4］，其中，以蜜环菌浓缩液及蜂王浆两味药材制成的脑心舒口服液主要用于身体虚弱、心神不安、失眠多梦、神经衰弱、头痛眩晕［5］。

睡眠是一种相对无意识的生理状态。睡眠不足是由于缺乏足够的恢复性睡眠而导致的。它是一种影响大脑和许多身体系统的应激源［6］。睡眠剥夺对机体的影响是整体的，多方面的，多层次的。从机体的行为学表现上，睡眠剥夺会使机体易疲惫，自主活动降低，学习记忆能力下降，情绪上易激惹。从机体的代谢层次上，睡眠剥夺会打破机体内的氧化和抗氧化平衡、神经递质平衡、中枢神经系统和外周神经系统的协调，从整体上影响机体的健康。对人类和大多数动物而言，睡眠不足是非常危险的，它会加快疾病的进程，缩短寿命［7］。睡眠对身体系统的影响是非常复杂的，研究已经证明睡眠剥夺对身体系统的不同影响取决于睡眠剥夺的长度和测量指标的时间框架［8-9］。

目前，对于睡眠剥夺的治疗多采用安定、唑吡坦等西药，服用后均有不同程度的不良反应，产生药物依赖。蜜环菌发酵液是一种由药食兼用蜜环菌发酵而来的非化学合成自然发酵基质，具有安全、易得的特点。已有大量研究表明，蜜环菌及其发酵液可延长戊巴比妥钠等西药诱导的小鼠睡眠时间［10］，因而，其被广泛认为具有镇静安神的效力，然而，鲜有研究直接以睡眠剥夺为模型来探究蜜环菌发酵液对中枢神经系统的影响。在本研究中，以更符合临床症状的睡眠剥夺为模型，来探讨蜜环菌发酵液对睡眠剥夺小鼠行为学及氧化应激水平的影响。

1 材料

1.1 动物 SPF 级昆明小鼠，4 周龄，体质量18～22 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，生产许可证号SCXK（辽）2015-0001。

1.2 仪器 自制小鼠水平台睡眠剥夺箱，ZZ-6 小鼠自主活动测试仪（成都泰盟科技有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；FD-2C 冷冻干燥机（国产）；352 型-酶标仪（芬兰Labsystems Multiskan MS）；TG16 W-微量高速离心机（国产）；GNP-9080 型隔水式恒温培养箱（国产）。

1.3 试剂 小鼠超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（18090328）、丙二醛（MDA）试剂盒（18090345），均购于江苏酶免实业有限公司；脑心舒口服液（170518），购于吉林敖东集团金海发药业股份有限公司，冻干，备用。

1.4 蜜环菌发酵液制备 实验用蜜环菌菌株来自吉林敖东延边药业股份有限公司，蜜环菌液体深层发酵培养12 d，过滤，60 ℃浓缩，采用脑心舒口服液的入药标准对蜜环菌发酵液进行质量检测，合格，冻干，备用。

2 方法

2.1 实验环境控制 室内温度（24±2）℃，相对湿度50%～60%，光照／黑暗周期为12 h／12 h。

2.2 小鼠睡眠剥夺模型的建立及分组给药 本实验采用多平台水环境法进行睡眠剥夺，即在睡眠剥夺箱（长30 cm、宽20 cm、高15 cm）中设置直径2 cm，高5 cm 的平台，每箱6 个，睡眠剥夺箱中注水，水面低于平台1 cm，水温保持在24 ℃左右。在睡眠剥夺箱中放入小鼠，小鼠可在平台之间活动站立，饮食饮水。在平台上小鼠可进入非快速动眼睡眠（NREM），但当小鼠进入快速动眼睡眠（REM）时，由于全身骨骼肌张力的下降，颈部肌张力也随之降低，使小鼠节律性低头、进而触水清醒，从而无法进入REM，就此达到睡眠剥夺的目的［11］。正常对照组小鼠使用直径6 cm的平台，小鼠可在平台上正常进入睡眠。50 只昆明小鼠，雌雄各半，随机分为5 组，每组10 只，分别为脑心舒口服液组，蜜环菌发酵液高、低剂量组，正常对照组，模型组。蜜环菌发酵液高、低剂量组分别按1 421.42 mg／kg、710.71 mg／kg 的剂量灌胃给药［12］，脑心舒口服液组按人鼠换算剂量1 226 mg／kg 灌胃给药，正常对照组和模型组给予蒸馏水。新到小鼠适应性饲养3 d，预灌胃5 d，第9 天开始每天对除正常对照组外的其它组小鼠采用多平台水环境法进行睡眠剥夺20 h（14：00～次日10：00），共睡眠剥夺60 h，睡眠剥夺期间继续给予试验药物。在睡眠剥夺20 h和40 h，灌胃给药1 h 后，分别对小鼠进行自主活动测试和负重游泳测试，末次灌胃给药1 h 后，眼球取血，颈椎脱臼处死，取脑。

2.3 小鼠行为学测试

2.3.1 自主活动测试 按照“2.2”项下分组给药方式进行分组给药，在睡眠剥夺20 h 灌胃给药1 h 后，将小鼠放入小鼠自主活动测试仪中适应5 min，之后记录小鼠在5 min内的活动次数和站立次数。在试验过程中，保持周围环境安静，无人员走动，避免外界因素对小鼠的干扰。

2.3.2 小鼠负重游泳实验 按照“2.2”项下分组给药方式进行分组给药，在睡眠剥夺40 h 灌胃给药1 h 后，对小鼠进行负重游泳测试。在小鼠尾巴根部固定小鼠体质量10%重量的铅块，将小鼠放入温度（24±2）℃，深度高于30 cm 的水箱中游泳，记录小鼠从开始游泳至沉入水下5 s不能浮出水面的时间。

2.4 氧化应激水平的检测 按照“2.2”项下分组给药方式进行给药，在末次灌胃给药1 h 后，眼球取血，3 500 r／min离心10 min，吸取上清。眼球取血后，颈椎脱臼处死小鼠，立即置于冰上取脑，用冰过的生理盐水将小鼠脑组织上的残血清洗干净，无菌滤纸吸干水分，称重，按脑组织与冰生理盐水1∶9 的比例进行匀浆，4 ℃，3 500 r／min离心10 min，取上清。采用小鼠超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒检测小鼠血清及脑组织中SOD 的活性和MDA 的水平。试剂盒的使用严格按照试剂盒的说明书进行操作。

2.5 统计分析 采用SPSS 23 软件进行数据分析，所有实验结果的数值都以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 行为学测试

3.1.1 小鼠自主活动 与正常对照组比较，模型组的活动次数和站立次数下降（P＜0.01），表示睡眠剥夺能明显降低小鼠的自主活动。与模型组比较，蜜环菌发酵液高剂量组能提高小鼠的自主活动，活动次数、站立次数增加（P＜0.01）；蜜环菌发酵液低剂量组站立次数增加（P＜0.05）。见表1。

表1 小鼠的自主活动和站立次数（， n＝10）

表1 小鼠的自主活动和站立次数（， n＝10）

注：与正常对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.1.2 小鼠负重游泳 与正常对照组比较，模型组小鼠的游泳时间下降（P＜0.01），表明睡眠剥夺能有效降低小鼠的抗疲劳能力。与模型组比较，蜜环菌发酵液高能延长小鼠的游泳时间（P＜0.01）。见表2。

表2 小鼠负重游泳时间（， n＝10）

注：与正常对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.2 氧化应激水平

3.2.1 小鼠血清和脑组织中MDA 水平 与正常对照组比较，模型组血清及脑组织中的MDA 水平均提高（P＜0.05，P＜0.01），表明睡眠剥夺能明显提高小鼠血清及脑组织中的MDA 水平。与模型组比较，蜜环菌发酵液高、低剂量组均能降低小鼠血清及脑组织中MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

表3 小鼠血清和脑组织中丙二醛（MDA）水平（，n＝10）

注：与正常对照组比较，∗P＜0.01，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2.2 小鼠血清和脑组织中SOD 活性 与正常对照组比较，模型组血清及脑组织中的SOD 活性均降低（P＜0.05），表明睡眠剥夺能明显降低小鼠血清及脑组织中的SOD 活性。与模型组比较，蜜环菌发酵液高、低剂量组均能一定程度上提高小鼠血清及脑组织中SOD 水平，差异无统计学意义。见表4。

表4 小鼠血清和脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性（， n＝10）

表4 小鼠血清和脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性（， n＝10）

注：与正常对照组比较，∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05。

4 讨论

自主活动是在无外界干预的条件下，通过小鼠在一定空间内的自发活动次数和站立次数来反映小鼠的精神行为兴奋性，刘长云等［13］人的研究结果表明，随着睡眠剥夺时长的增长，大鼠的行为兴奋性表现为先兴奋后抑制，在本实验的睡眠剥夺强度下呈现的结果与该结果一致。负重游泳是一种强迫小鼠游泳的行为学测试方法，通过游泳的时间来反映小鼠对疲劳的承受能力，是一种衡量小鼠整体机体组织和脏器状态的评价方法，许光辉等［14］人的研究结果显示，睡眠剥夺能显著降低小鼠的抗疲劳能力，该结果与本研究结果一致。当给予睡眠剥夺小鼠一定剂量的蜜环菌发酵液后，在自主活动及负重游泳测试中，小鼠的相应指标均得到了提高，与正常对照组差异不显著，说明蜜环菌发酵液能很好的缓解睡眠剥夺造成的小鼠行为学指标的异常。

活性氧（ROS）是线粒体呼吸和其它细胞代谢过程的自然副产品，对氧化还原信号和细胞功能至关重要。它们在正常条件下被细胞抗氧化机制安全地代谢。然而，如果ROS 的生成超过细胞的抗氧化能力，非生理的毒性ROS 就会在氧化应激的过程中被释放。一般来说，氧化应激是细胞功能障碍和细胞死亡的标志，这是由于非生理性ROS 与蛋白、核酸、碳水化合物和脂质发生了非正常反应导致的［15］。SOD 是一种能清除体内超氧阴离子自由基的重要酶类［16］。MDA 是机体内氧自由基攻击细胞膜上的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化后的主要产物，通常被认为是脂质过氧化的指标［17］。倪娜娜［18］研究结果显示，睡眠剥夺会显著降低小鼠蓝斑神经元的抗氧化水平，何亮［19］的研究结果显示，睡眠剥夺会显著降低小鼠血浆、心肌组织和脑组织的SOD 活性，增加其MDA 水平，本实验的检测结果与前人的结果一致。当睡眠剥夺小鼠被给予一定剂量的蜜环菌发酵液后，对其脑组织及血清中的MDA 水平和SOD活性进行检测，结果显示，小鼠脑组织及血清中的MDA 水平均显著下降，而SOD 水平未有明显提高。由该结果猜测，MDA 水平的下降，说明小鼠体内的ROS 水平较少，氧化程度较低，故SOD 活性也相应降低，抗氧化强度也较小。翟凤艳［20］、杜刚与潘云峰等［21-22］人的研究结果显示，蜜环菌乙醇提取物及蜜环菌油等均具有体外直接清除ROS的功效，从侧面证明蜜环菌具有清除ROS 的作用，但要直接证明该猜测，还需检测小鼠体内ROS 的水平。

本研究结果显示，蜜环菌发酵液对睡眠剥夺小鼠的行为异常有很好的缓解作用，且能有效降低小鼠体内的氧化应激水平，为蜜环菌菌物药的开发提供数据支持，也为治疗中枢神经系统疾病的药物开发提供选择。