样品保存液在猪口腔液检测中的应用

柴伟东

（勃林格殷格翰动物保健（上海）有限公司，上海 200040）

近些年来，国内外动物医学界对猪口腔液的研究报道日渐增多和深化，特别是国内非洲猪瘟发生以来，多个研究证实口腔液中的病毒检出时间点比血液中早1～4 d[1]，表面口腔液可作为血清样品的替代品，早期监测和评估猪群整体健康状况的诊断样品。猪口腔液由唾液和血清渗出液组成，除水分之外还有具有生物效能的黏液素、淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶等成分，同时猪口腔液中有大量的细菌及外界的粪便、饲料等复杂成分。

目前普遍认可的口腔液保存方法是将样品置于生理盐水中，储运在有蓝冰（冰袋）的条件下，温度可维持在0～8 ℃，最好在24 h内检测。在实践中，大量样品的采集持续时间较久，样品并没有一直维持在冷藏环境中，有时候运输距离也较远，时间超过了24 h，用常规的生理盐水方法保存和运输样品，使得口腔液样品中的核酸酶及细菌大量增殖产生的蛋白成分可能会导致其中的病毒核酸容易降解，进而影响核酸提取质量及检测结果。针对病毒特性和不同类型的样品特点，应确定相应的储运温度和样品保护液的使用。

表1 引物和探针序列

1 材料和方法

1.1 猪口腔液样品的采集

在早晨饲喂前，猪只最活跃的状态下采集口腔液。取直径1.6 cm，长度1 m的棉绳，将两端松散，两端下垂悬挂在饲喂栏上，绳子尽量离开地面和污染的栏柱，绳子末端与猪肩胛部高度相同，保证猪容易接触到，让猪自由咀嚼30 min，将棉绳湿润的末端放入密封袋，用力挤压，将挤出来的口腔液转移到离心管中。样品运输到实验室后对样品不进行离心处理，直接冷冻保存。

1.2 实验环境

所有实验步骤均在生物安全二级（BSL-2）实验室内完成，其中病毒参考品的制备，样品分组以及样品核酸提取均在生物安全柜内操作。

1.3 参考品的制备

对上述口腔液应用核酸检测方法排除了PRRS和PR病原。将口腔液分为2组，每 ml加入100 μL病毒原液，制成2种病毒的参考品，使参考品初始病毒核酸量在105～106copies/μL范围之间。

1.4 样品分组及保存

将参考品按1∶10的比例加入生理盐水中，涡旋混匀后，按每管210 μL分装制成生理盐水组样品，分别置于4 ℃冰箱（2～8 ℃）、室温（22～25 ℃）和高温（40 ℃）条件下保存1 d、3 d和7 d。商业化的样品保存液A、B和C组样品以同样的方式处理。分别于各个时间点取两个平行样品置于-80 ℃保存。

1.5 样品核酸提取

取各个时间点样品200 μL，用赛默飞公司的MagMAX™ CORE Nucleic Acid Purification Kit核酸提取试剂盒进行样品核酸提取。

1.6 探针法实时荧光定量PCR方法检测

PRRSV的qRT-PCR方法使用Takara公司的一步法试剂（One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit），PRV的qRT-PCR方法使用北京擎科公司的试剂（2XT5 Fast qPCR Mix (Probe)）。引物和探针序列见表1。用天隆Gentier 32R实时PCR系统对各样品进行荧光PCR分析。以1×100～1×106copies/μL的稀释质粒样品制作标准曲线，计算各样品的病毒检出量。

2 结果

2.1 参考品初始病毒核酸量及其CT值

本实验以参考品0 d时检测的病毒检出量为基值，计算并比较各时间点样品病毒检出量的变化。其中PRRSV参考品0 d时CT值为21.24，病毒核酸量为1×105copies/μL；PRV参考品0 d时CT值为22.91，病毒核酸量为1×105copies/μL。

2.2 样品保存液对口腔液样品中核酸检出量的影响

在第3天冷藏环境中，生理盐水组在第3天时PRRS病毒检出量低于50%，PR病毒检出量下降18%，低于样品保存液组；3种不同的商业保存液A、B、C都对病毒核酸有较好的保护作用，没有差异。在第3天常温和高温环境中，生理盐水组PRRS病毒检出量低于70%～80%，PR病毒检出量下降30%～40%，低于样品保存液组；3种不同的商业保存液A、B、C都对病毒核酸有较好的保护作用，没有显著差异。

在第7天冷藏环境中，生理盐水组在第7天的时候PRRS病毒检出量低于90%，PR病毒检出量下降36%，低于样品保存液组；3种不同的商业保存液A、B、C都对病毒核酸有较好的保护作用，没有显著差异。在第7天常温和高温环境中，生理盐水检测不出PRRSV，PR病毒检出量下降到80%以下，显著低于样品保存液组；3种不同的商业保存液A、B、C都对病毒核酸有的保护作用，虽然没有显著差异，但以样品保存液A的保护核酸效果较为优秀。如图1所示。

3 讨论

猪口腔液在疾病诊断、检测和健康状态分析等方面已得到了良好的推广应用，但口腔液样品的储运一直是其应用的限制因素之一。口腔液样品成分复杂，含有大量的酶类（包括核酸酶），而这些样品中的病毒等检测的靶标为病毒的核酸，极易受到样品中核酸酶的影响而降解。此外，口腔液中大量的细菌增殖所产生的毒素与大蛋白分子对病毒核酸和样品处理也带来了极大的干扰。用常规生理盐水，即使储运于冷藏环境，也无法做到很好的保护样品中病毒核酸的作用。因此，需要尽早抑制样品中RNA酶活性及病原的增殖。

目前市面上商业化的样品保存液有多种，成分包括表面活性剂、异丙醇、无水乙醇、铵盐等单品或多种复合成分，作用主要为杀死样品中的病原微生物和保护释放出来的核酸。通过比较3种商用样品保存液与生理盐水的区别，发现现有的保存液A、B和C在不同温度和时间条件下都有保护PRRSV和PRV的作用，彼此之间没有显著差异，但对RNA病毒的保护作用在第7天明显下降；而常规使用的生理盐水在各种条件下均不能保护口腔液样品中的核酸，在第7天的时候已检测不到PRRSV。

此外，温度在样品储运中也起到至关重要的作用。实验中4 ℃保存条件的2种病毒参考品的核酸量降低幅度都小于室温和高温条件，说明低温运输有利于获得正确样品核酸检测值。干冰的温度为-74 ℃，对病毒核酸样品的保护更有利，但干冰运输的成本较高。使用蓝冰冷藏运输并结合使用任何一种样品保存液作为保护剂，在7 d的时候PRRSV的检出量仍高于30%，PRV的检出量高于80%。而7 d的时间足够将口腔液样品从国内北方运输到南方，并完成检测，其检测结果较为可靠。因此，以样品保存液为样品保护剂和蓝冰冷藏运输配套即可基本满足口腔液样品中病毒核酸检测的需求。

为了更好地测试保存和运输条件对于口腔液中病毒核酸样品的影响，实验所使用的模拟样品的起始浓度为1×105～1×106copies/μL，检测的CT值为20～23，此样品浓度在实时荧光定量PCR检测方法的最佳检测范围内[4]。但实验的模拟样品与实际口腔液样品相比其病毒核酸浓度偏高，其目的在于展示储运条件对于核酸样品检测的影响。实际口腔液样品携带其他病毒的样品对储运条件的敏感性也可以进行类似的实验。