6种植物源类杀虫剂对地熊蜂工蜂的室内毒力测定及风险评估

王 烁,谢丽霞,陈 浩,吴光安,张善衡,周 浩,于 毅,郑 礼,闫 毅*,翟一凡*

(1.山东农业大学植物保护学院，中国 泰安 271000；2.山东省农业科学院植物保护研究所，中国 济南 250100；3.临沂大学农林科学学院，中国 临沂 276000)

熊蜂为膜翅目Hymenoptera蜜蜂总科Apoidea熊蜂属Bombus昆虫，具有飞行声震大、采集花粉能力强、耐低温等不良环境以及趋光性弱等优点[1,2]，作为设施农业重要的授粉昆虫之一，熊蜂有着极高的应用推广价值。目前欧盟国家已普遍使用熊蜂授粉技术替代传统的震动授粉与激素点花授粉，在我国设施农业生产中的应用面积也在逐步扩大。熊蜂授粉技术已成为世界公认的绿色食品安全生产中的一项重要技术手段。

与此同时，化学农药仍是设施农业生产中减少病虫害损失的主要技术手段，但熊蜂对高风险化学农药具有高敏感性，而常用杀虫剂普遍对熊蜂有较高的毒性，如新烟碱类杀虫剂等，对熊蜂等授粉昆虫危害较大，除了影响正常的授粉效果外还对授粉昆虫的学习、取食、繁殖等行为产生影响[3-8]。因此，在现代设施农业中，人们面临着使用化学农药防治病害虫的需要和保护利用熊蜂等授粉昆虫的需要之间的矛盾。由此可见，筛选和使用对熊蜂低毒、低风险的化学农药显得尤其重要。

植物源类杀虫剂具有可生物降解性、改变目标害虫行为的能力和良好的安全性等优点，有望在实现病虫害绿色防控中发挥重要作用[9]。目前关于植物源药剂对熊蜂等授粉昆虫的毒力测定及风险评估研究较少。周浩[2]等研究表明苦参碱对熊蜂为中毒；李正阳[10]等研究发现印楝素和藜芦碱对熊蜂为低毒；豆敏详[11]等研究发现苦参碱制品对蜜蜂为低毒；刘哲鹏[12]等研究表明鱼藤酮制品对蜜蜂也为低毒，陈昂[13]对包括印楝素等5种植物源农药评价了对蜜蜂等非靶标生物的环境毒性影响，结果表明，印楝素为剧毒，除虫菊素和鱼藤酮为中毒，苦参碱和蛇床子素为低毒。

在此背景下，本研究选取了设施蔬菜生产中6种常见植物源类杀虫剂，通过研究它们对地熊蜂工蜂的急性毒性及生态风险评估，以期筛选出安全、生态、高效的植物源类杀虫剂用于熊蜂授粉的设施农业环境，减少对熊蜂等授粉昆虫的危害。为在设施农业生产中安全、生态、高效地使用植物源类杀虫剂提供科学依据，同时为我国开展植物源类杀虫剂对熊蜂的安全性评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试蜂种为地熊蜂工蜂，购自山东鲁保科技开发有限公司，于温度(25±2) ℃、相对湿度(60±10)%、黑暗条件下进行饲养，饲养过程未接触化学农药和试剂。试验所用地熊蜂均为个体大小基本一致的健康成年工蜂。

1.2 供试药剂

供试药剂为2%苦参碱水剂(河北瑞宝德生物化学有限公司)、6%鱼藤酮微乳剂(北京三浦百草绿色植物制剂有限公司)、0.5%藜芦碱可溶液剂(陕西康禾立丰生物科技药业有限公司)、1%苦皮藤素乳油(河南省新乡市东风化工厂)、1.5%除虫菊素(内蒙古清源保生物科技有限公司)、0.4%蛇床子素乳油(湖北天惠生物科技有限公司)。

1.3 植物源类杀虫剂对地熊蜂的毒力测定

参考我国《化学农药环境安全评价试验准则，第10部分:蜜蜂急性毒性试验》[14]，将农药对地熊蜂的毒性划分4个等级(以有效成分计)：低毒(LD50值>11.0 μg a.i.·蜂-1)；中毒(2.0 μg a.i.·蜂-1

1.3.1 急性经口毒性 参照《化学农药环境安全评价试验准则第10部分：蜜蜂急性毒性试验》，将各供试杀虫剂母液用质量分数为50%的蔗糖水溶液稀释成5个浓度梯度，按每头蜂取食20 μL的量在饲喂器中加入不同浓度的药剂200 μL，将饥饿处理2 h的成年工蜂移入蜂笼，每个蜂笼10头成蜂，每个处理重复3次，并设50%蔗糖水为空白对照。饲喂3 h待药剂消耗完后添加充足50%蔗糖水继续饲养，记录24和48 h地熊蜂工蜂死亡数，计算地熊蜂工蜂的死亡率。

1.3.2 急性触杀毒性 参照《化学农药环境安全评价试验准则第10部分：蜜蜂急性毒性试验》，用丙酮配置的母液稀释成5个浓度梯度。用微量点滴仪将不同浓度的供试药剂按每头蜂2 μL点滴在用CO2麻醉后的地熊蜂工蜂的中胸背板上，待蜂身晾干后转入蜂笼中，用充足的50%蔗糖水饲喂，每个蜂笼10头成蜂，每个处理重复3次，并设丙酮为空白对照。记录24和48 h地熊蜂工蜂死亡数，计算地熊蜂工蜂的死亡率。

1.4 植物源类杀虫剂对地熊蜂工蜂的风险评估

植物源类杀虫剂对地熊蜂工蜂的风险评估参照欧洲和地中海植物保护组织所采用的危害熵(hazard quotient，HQ)值。HQ值为农药田间推荐用量(AR)(g a.i.·hm-2)与农药对地熊蜂工蜂急性经口或接触LD50值(μg a.i.·蜂-1)的比值。

HQ值>2 500，高风险;50

1.5 数据处理

利用Probit软件对试验内容所得数据进行统计分析，计算得出毒力回归方程、95%置信区间、LD50及LD90值，并分析每种农药对地熊蜂工蜂的毒性等级。根据试验数据进行生态风险评估。

2 研究结果

2.1 6种植物源类杀虫剂对地熊蜂工蜂的急性经口毒力

由表1结果可知，通过饲喂法测得的地熊蜂工蜂24 h急性经口毒性从大到小顺序为：苦皮藤素、藜芦碱、蛇床子素、鱼藤酮、苦参碱、除虫菊素，LD50值分别为：0.04，0.14，3.21，5.39，8.66，49.69 μg a.i.·蜂-1；48 h急性经口毒性从大到小顺序为：苦皮藤素、藜芦碱、蛇床子素、鱼藤酮、苦参碱、除虫菊素，LD50值分别为：0.03，0.09，2.96，4.18，5.47，44.96 μg a.i.·蜂-1。

地熊蜂工蜂急性经口毒性试验无论是24 h或是48 h，测定结果均为苦皮藤素毒性最高，除虫菊素毒性最低，6种植物源类药剂24 h的LD50值均大于48 h的LD50值，但24 h急性经口毒性大小顺序与48 h急性经口毒性大小顺序一致。同时根据我国《化学农药环境安全评价试验准则，第10部分:蜜蜂急性毒性试验》中农药对蜜蜂急性毒性分级标准，6种植物源杀虫剂中急性经口毒性苦皮藤素和藜芦碱为高毒，除虫菊素为低毒，其余3种为中毒。

表1 6种植物源类杀虫剂对地熊蜂工蜂的急性经口毒性

CL：置信限(Confidence limit)，下同。

2.2 6种植物源类杀虫剂对地熊蜂工蜂的急性触杀毒力

由表2结果可知，通过接触法测得的地熊蜂工蜂24 h急性触杀毒性从大到小顺序为：藜芦碱、苦皮藤素、蛇床子素、除虫菊素、鱼藤酮、苦参碱，LD50值分别为：0.56，0.90，1.06，33.39，34.30，37.31 μg a.i.·蜂-1；48 h急性触杀毒性从大到小顺序为：藜芦碱、苦皮藤素、蛇床子素、鱼藤酮、苦参碱、除虫菊素，LD50值分别为：0.37，0.72，0.87，21.85，22.00，25.48 μg a.i.·蜂-1。与急性经口毒性结果不同，对地熊蜂工蜂急性触杀毒性24与48 h最高的均为藜芦碱，最低的为苦参碱(24 h)和除虫菊素(48 h)。6种植物源类杀虫剂24 h的LD50值均大于48 h的LD50值，且24 h急性触杀毒性大小顺序与48 h急性触杀毒性大小顺序不一致。根据我国《化学农药环境安全评价试验准则，第10部分:蜜蜂急性毒性试验》中农药对蜜蜂急性毒性分级标准，6种植物源杀虫剂中急性触杀毒力藜芦碱、苦皮藤素和蛇床子素为高毒，其余均为低毒。

表2 6种植物源类杀虫剂对地熊蜂工蜂的急性触杀毒性

2.3 6种植物源类杀虫剂对地熊蜂工蜂的生态风险评估

通过饲喂法和接触法测得48 h的LD50值计算得到6种植物源类杀虫剂对地熊蜂工蜂的危害熵值(HQ)如表3所示。6种供试制剂中，苦参碱、鱼藤酮、除虫菊素和蛇床子素的经口与接触危害熵均小于50，为低风险；苦皮藤素与藜芦碱的经口危害熵在50～2 500，为中等风险，而接触风险熵小于50，为低风险。

表3 6种植物源杀虫剂对地熊蜂工蜂的危害熵值

3 结论与讨论

本试验测定结果表明，急性经口与急性触杀两种方法所得结果存在差异，在试验设计时需要同步进行。6种药剂中除蛇床子素与除虫菊素外，其余药剂的触杀毒性的LD50值均大于经口毒性。此外，苦参碱、鱼藤酮和蛇床子素的经口毒性高于触杀毒性，而苦皮藤素、除虫菊素和藜芦碱的经口毒性与触杀毒性一致。但6种药剂无论是经口毒性还是触杀毒性在24 h与48 h的结果对比上一致，24 h的LD50值均大于48 h值。根据试验结果所得，植物源类杀虫剂对地熊蜂的毒性并不一致，而是高、中、低毒均有，可能与各药剂的作用机制有关，触杀、胃毒和内吸等作用程度不同导致对地熊蜂的毒性也产生了差异。但总体来说，相较于新烟碱类杀虫剂等对授粉昆虫整体毒性较高的杀虫剂而言[15，16]，植物源类杀虫剂的毒性整体偏低，高毒较少。这与李正阳[10]、周浩[2]等人的研究结果一致，但在具体药剂的毒性上还存在一定偏差。此外，该结果与蜜蜂等其他授粉昆虫的毒性结果[17]也一致。可见这6种植物源类杀虫剂对地熊蜂的毒性整体较低，具有用于设施农业授粉环境的可能。

本试验采用的风险评估程序为欧洲与地中海植物保护组织采用的标准，如果按照我国风险评估的程序，即参照NY/T2882.4—2016《农药登记环境风险评估指南第4部分: 蜜蜂》来进行风险评估，结果除苦皮藤素与藜芦碱外，均为可接受。因此，从生态风险角度两种标准的结果也印证了结论，但具体药剂的筛选还需要进一步的田间试验加以印证。

通过室内毒力测定，测得苦参碱对地熊蜂的经口毒性为低毒，但周浩[2]等人的研究结果为中毒，分析原因可能为所用制剂的浓度与厂家不同所致，建议今后进行室内毒力测定试验时尽量使用原药，防止结果存在偏差。豆敏详[11]、陈昂[13]等人的研究表明苦参碱对蜜蜂为低毒，与本研究一致。此外，李正阳[10]等人测定藜芦碱对地熊蜂为低毒，而本试验为高毒，具体原因需要进一步分析验证。刘哲鹏[12]等人的研究证明鱼藤酮对蜜蜂低毒，与本试验对地熊蜂结果一致。国内暂未有植物源杀虫剂对凹唇壁蜂的室内毒力测定试验数据。

由于大多数合成农药对人类和环境的危害，害虫管理正面临着全球性的经济和生态挑战。长期以来，植物源类杀虫剂一直被认为是害虫管理中合成化学农药的替代品，如Pant[18]等人指出，使用生物杀虫剂，包括微生物制剂、生化杀虫剂和植物制剂，被认为是管理和控制各种害虫的更有说服力的策略。生物化学农药和植物性农药具有杀虫和驱虫的特性，具有良好的靶向性、生物降解性和经济可行性，已成为合成农药的较好替代品；Sarwar[19]等人研究表明，利用植物产品进行生物控制是生态友好的，对环境的负面影响大大减少。一些较新的植物源类杀虫剂对哺乳动物的毒性较低；于宏伟[20]等人也认为，与传统农药相比，植物源农药具有毒性低、无污染、对有益生物安全、高效、开发费用低等一系列优点。但也有研究表示目前只有少数植物制剂在工业化国家的农业中得到应用，植物源类杀虫剂被过度吹捧，新植物产品的商业开发前景也很渺茫[21]。

现阶段对于授粉昆虫的毒力测定试验大多集中在新烟碱类杀虫剂以及田间常用的杀虫杀菌剂上，而且主要集中于蜜蜂，对熊蜂等研究较少，更缺少对某一大类药剂的研究分析。此外，Stoner[22]的研究指出，蜂王更容易直接接触杀虫剂，但现阶段几乎没有研究过杀虫剂对熊蜂蜂王的影响。因此，对于熊蜂蜂王和雄蜂的室内毒力测定还需进一步探索。

国外研究人员在对蜜蜂的亚致死效应和急性毒性研究中提出了更为谨慎的观点。Tschoeke[23]等人的研究指出，植物源杀虫剂的田间应用可能与合成化合物的应用具有同样的风险，这些替代产品应开展与合成产品同样的风险评估。Ndakidemi[24]等人也认为，应谨慎使用植物源类杀虫剂来控制农作物上的害虫。同样，应该评估这些杀虫剂对非靶标生物(如授粉者)产生副作用的潜在风险，有研究表明评估杀虫剂对非目标生物的潜在风险对于优化生态系统服务(例如自然虫害控制或授粉)，提高农业产量至关重要，需要更多的研究来确定植物和合成杀虫剂对捕食者、寄生蜂和传粉者的副作用[25,26]。接下来的研究中，除了杀虫剂导致的直接死亡外，我们还将考虑杀虫剂对节肢动物生理和行为的亚致死影响，开展相应的风险评估，以便于更加全面地验证其对熊蜂等授粉昆虫的影响，为进一步指导生产实际提供理论支撑。