表面增强拉曼光谱法快速检测中成药中吡罗昔康

宋健

(江苏省计量科学研究院，南京 210023)

近年来，随着人们生活水平的提高以及国家对中医药事业的重视，中药以其收费低、疗效好、副作用小等特点，备受广大人民群众推崇，其市场规模不断扩大。然而，一些不法商家为了追求快速起效，牟取更多利益，在中药中违法添加各类处方西药，患者不明真相地滥用药物，带来严重的副作用，导致各种症状的出现。吡罗昔康是非甾体抗炎药，一般用于治疗风湿性及类风湿性关节炎，但对胃肠道刺激比较大，长期服用会导致胃炎或胃溃疡，甚至可能出现中性粒细胞减少、肝功能异常等症状。因其具有明显的镇痛、抗炎功效，不良商家将其添加至抗风湿类中成药中以提高疗效。

目前中成药中掺伪添加的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱–质谱法(LC–MS)和超高效液相色谱法(UPLC)等［1–3］。上述方法分析时间长、费用高、专业性强，难以满足市场监管的需求，因此建立一种快速检测中成药中非法添加物的方法具有重要意义。表面增强拉曼光谱(SERS)技术是目前发展较快的一种分析技术，通过纳米增强试剂将拉曼信号增强106～109倍，弥补了拉曼散射效应信号较弱、难以检测微痕量物质的缺陷。SERS 技术在现场快速检测方面具有明显优势，已在违禁添加剂［4–6］、农兽药残留［7–8］、保健品掺伪［9–10］、化妆品违禁添加［11］等食药妆领域得到广泛应用，但目前利用SERS 技术检测抗风湿类中成药中违禁添加吡罗昔康的研究还未见报道。笔者利用便携式表面增强拉曼光谱技术，建立了一种中成药中掺伪添加的快速筛查方法，为准确判断中成药中是否含有吡罗昔康等西药成分提供技术支持，也为后续研究其它中成药掺伪添加的快速筛查提供新思路。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

便携式拉曼光谱仪：SSR–3000 型，激光波长为785 nm，光谱范围为180～2800 cm–1，南京简智仪器设备有限公司；

金纳米表面增强试剂(SSN–2 试剂)：金纳米粒径为45～55 nm，南京简智仪器设备有限公司；

吡罗昔康标准品：纯度为98%，北京坛墨质检科技有限公司；

甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯：分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；

N-丙基乙二胺(PSA)：粒径为40～63 μm，100 g，天津博纳艾杰尔科技有限公司；

石墨碳化黑(GCB)：粒径为37.4～125 μm，100 g，天津博纳艾杰尔科技有限公司；

同仁堂牌牛黄解毒片、修正牌复方金银花颗粒、三精牌双黄连口服液、白云山牌清开灵胶囊、王老吉牌广东凉茶颗粒：上元堂大药房；

实验用水为超纯水。

1.2 溶液配制

吡罗昔康标准储备溶液：10 mg／mL，准确称取0.1 g(精确至0.000 1 g)吡罗昔康标准品，置于10 mL 容量瓶中，加入乙酸乙酯溶解并定容至标线，混匀。

吡罗昔康标准中间溶液：用乙酸乙酯将吡罗昔康标准储备溶液逐级稀释至吡罗昔康的质量浓度分别为1.0，0.1 mg／mL 的标准中间溶液。

吡罗昔康系列标准工作溶液：将吡罗昔康标准中间溶液用乙酸乙酯逐级稀释至吡罗昔康的质量浓度分别为5，1，0.1，0.05 mg／L的系列标准工作溶液。

1.3 阳性样品制备

牛黄解毒片、清开灵胶囊阳性样品：将牛黄解毒片样品研磨至粉状，清开灵胶囊取内容物。分别称取牛黄解毒片粉状、清开灵胶囊内容物样品各5份，每份均为0.5 g(精确至0.01 g)，分别加入质量浓度为0.1 mg／mL 的吡罗昔康标准中间溶液1，2.5，5，25，50 μL，配制成吡罗昔康含量分别为0.2，0.5，1.0，5.0，10.0 mg／kg 的吡罗昔康阳性样品溶液。

双黄连口服液、金银花颗粒、广东凉茶颗粒阳性样品：分别量取双黄连口服液、金银花颗粒、广东凉茶颗粒样品(液体样品直接量取，固体颗粒按说明书冲泡后量取)各5 份，每份均为10 mL，分别加入质量浓度为1.0 mg／mL 的吡罗昔康标准中间溶液2，5，10，50，100 μL，配制成吡罗昔康含量分别为0.2，0.5，1.0，5.0，10.0 mg／kg 的吡罗昔康阳性样品溶液。

1.4 样品前处理

取一定量的样品(片剂研磨至粉状称取约0.5 g，胶囊取内容物直接称取约0.5 g，液体口服液直接量取0.5 mL，固体颗粒按说明书冲泡后量取0.5 mL)于5 mL 离心管中，加入2 mL 乙酸乙酯提取剂，超声5 min，以4 000 r／min 转速离心1 min。取上层清液1.5 mL 于5 mL 离心管中，加入20 mg GCB和10 mg PSA 净化剂，充分振荡，以4 000 r／min 转速离心1 min，取上层清液作为待测液。

1.5 仪器工作条件

激光功率：450 mW；积分时间：10 s。

1.6 检测方法

分别取SSN–2 增强试剂200 μL、待测液10 μL 于1.5 mL 玻璃瓶中，混匀，在1.5 仪器工作条件下，检测混合溶液的拉曼光谱。

2 结果与讨论

2.1 吡罗昔康拉曼特征峰组确定

在1.5 仪器工作条件下，将吡罗昔康标准品加入样品瓶中直接进行拉曼光谱检测，质量浓度为5 mg／L 的吡罗昔康标准工作溶液和空白溶液分别按照1.6 方法进行检测。吡罗昔康标准品、吡罗昔康标准工作溶液及空白溶液的拉曼光谱图如图1 所示。

由图1 可以看出，吡罗昔康标准品标示的拉曼峰 分 别 为348，405，578，646，773，818，874，1 159，1 274，1 357，1 542，1 601 cm–1，与文献［12］的研究结果一致，说明标示的拉曼峰确实为吡罗昔康的拉曼特征峰。质量浓度为5 mg／L 的吡罗昔康标准工作溶液谱图中标示的拉曼峰分别为348，402，576，650，781，826，877，1 152，1 276，1 355，1 542，1 589 cm–1，除个别峰有微小漂移外，其拉曼峰与吡罗昔康标准品的拉曼特征峰大致相同。空白溶液的测试谱图中并没有出现吡罗昔康的拉曼特征峰。综合考虑吡罗昔康在金纳米增强体系中的拉曼峰强度和峰形，最 终 选 择576，650，781，826，877，1 152，1 542，1 589 cm–18 个拉曼特征峰作为定性检测吡罗昔康的拉曼特征峰组。

图1 吡罗昔康拉曼光谱图

2.2 提取剂选择

目前中成药中掺伪成分的检测一般采用甲醇、乙腈等有机溶剂提取［13–17］，考虑到吡罗昔康易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等脂溶性有机溶剂，因此分别选择甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯4 种溶剂作为提取剂，其它实验条件不变，按1.4 样品前处理方法对吡罗昔康含量为5 mg／kg 的牛黄解毒片阳性样品进行处理，按1.6 方法分别进行拉曼光谱检测，考察不同提取剂的提取效果，结果如图2 所示。

图2 不同溶剂提取的拉曼光谱图

由图2 可以看出，4 种溶剂的提取效果：甲醇＜乙腈＜二氯甲烷＜乙酸乙酯。样品经甲醇和乙腈提取后，吡罗昔康拉曼特征峰只有部分出现，匹配比例分别为37.5%和87.5%，且提取液的信号大幅度减弱，这是因为吡罗昔康在甲醇、乙腈中的溶解度均较小，甲醇和乙腈的提取效率较低，提取液中吡罗昔康的浓度远小于样品溶液的浓度。而样品经二氯甲烷和乙酸乙酯提取后有尖锐的拉曼特征峰，匹配比例均为100%。因乙酸乙酯比二氯甲烷毒性低，对操作人员的危害小，因此选择乙酸乙酯作为提取剂。

2.3 净化剂优化

以吡罗昔康含量为5 mg／kg 的牛黄解毒片阳性样品作为待测样品，以乙酸乙酯为提取剂，分别采用不同用量的GCB 和PSA 净化剂对样品进行前处理，然后按1.6 方法进行检测，考察不同净化剂用量对样品前处理效果的影响，结果如图3 所示。

图3 不同净化剂用量时的拉曼光谱图

由图3 可以看出，没用净化剂时，除1 542，1 589 cm–1两个主特征峰外，其它几个特征峰的信号强度均较小，且在400～500 cm–1之间有一个较大的杂质干扰峰。在使用不同用量的净化剂后，吡罗昔康拉曼特征峰信号强度都有所增大，且滤除了杂质峰，在GCB 用量相同的情况下，加入20 mg PSA 时的吡罗昔康拉曼特征峰信号强度略小于加入10 mg PSA 时的强度，这可能是PSA 具有一定的吸附作用所致。当PSA 用量均为10 mg 时，分别加入10，20，30 mg 的GCB，结果发现当GCB 用量为20 mg时，吡罗昔康拉曼特征信号强度最大，净化效果最佳。结果表明虽然GCB 可以去除样品中部分干扰色素，从而提高检测效果，但与PSA 一样，GCB 对部分药物具有一定的吸附作用，因此需要选择一个合适的用量，既可以最大程度除去色素干扰，又尽量减少其对药物的吸附，以达到最佳净化效果。综合考虑，选择20 mg GCB+10 mg PSA组合作为净化剂。

2.4 标准样品溶液检出限

以吡罗昔康系列标准工作溶液作为待测液，按1.6 方法分别进行拉曼光谱检测，不同浓度的吡罗昔康标准工作溶液具有拉曼特征峰组中全部或部分谱峰，匹配比例不小于50%时认为有检出，小于50%时为未检出。不同浓度吡罗昔康标准溶液的增强拉曼谱图如图4 所示。

图4 不同浓度吡罗昔康标准溶液的拉曼光谱图

由图4 可以看出，吡罗昔康拉曼信号在一定范围内随浓度的降低而减弱，当吡罗昔康的质量浓度为0.1 mg／L 时，特征峰的匹配比例为75%，而当浓度降至0.05 mg／L 时，匹配比例明显低于50%，几乎观察不到吡罗昔康的拉曼特征峰，谱图与空白溶液极其相近，表明吡罗昔康未检出。综上所述该方法吡罗昔康标准样品的检出限为0.1 mg／L。

2.5 方法评价

2.5.1 方法检出限

按1.4 方法对1.3 中的牛黄解毒片阳性样品进行前处理，然后按1.6 方法进行拉曼光谱检测，结果如图5 所示。

图5 牛黄解毒片阳性样品的拉曼光谱图

由图5 可看出，当样品中吡罗昔康含量不小于1 mg／kg 时，拉曼峰型明显且能识别出吡罗昔康全部拉曼特征峰；当吡罗昔康含量降至0.5 mg／kg 时，检测出5 个吡罗昔康特征峰，匹配比例降至62.5%；当吡罗昔康含量降至0.2 mg／kg 时，匹配比例低于50%，可以认为未检出。因此该方法的检出限为0.5 mg／kg。考虑到中成药掺伪的实际情况，一般情况下每千克中成药掺伪的质量为几百毫克甚至高达几千毫克，所以该检出限完全满足检测需求。

2.5.2 基质普适性

按1.3 阳性样品制备方法，分别以金银花颗粒、双黄连口服液、清开灵胶囊以及凉茶为空白基质制备阳性样品，验证基质的普适性，结果如图6 所示。

图6 吡罗昔康在不同剂型基质中的拉曼光谱图

由图6 可以看出，该方法可用于检测上述4 种样品基质中的吡罗昔康，其中金银花颗粒和双黄连口服液阳性样品的检出限为0.5 mg／kg，清开灵胶囊和凉茶阳性样品的检出限为1 mg／kg。

3 结语

建立了表面增强拉曼光谱法快速检测中成药中吡罗昔康的方法。该方法具有检出限低、分析范围广、操作方便简单、分析速度快等特点，可用于中成药中违禁添加抗风湿解热镇痛类药物的快速检测。