FGG在结直肠癌中的表达及意义

2020-03-26马舒婷刘金华

中国实验诊断学 2020年3期

马舒婷，谢风，刘金华，李威

(吉林大学中日联谊医院检验科，吉林长春130033)

纤维蛋白原γ链(FGG)是纤维蛋白原(FG)的一种组分,DNA分析显示是10.5 kb中存在10个外显子和9个内含子[1]的片段。人血浆中FG主要由肝脏产生，由α，β以及γ三条多肽链以二硫键为连接方式组成[2]，三条多肽链分别由FGA、FGB以及FGG基因编码。FGG可在凝血过程中发挥功能，同时在早期创伤性修复中具有稳定病灶和引导上皮细胞迁移的作用。本研究旨在探究FGG在结直肠癌和其癌旁组织中的表达情况以及差异性，探讨FGG与肿瘤的发生及发展间的关系，进而为临床提供诊断依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

23例结直肠癌患者(均被吉林大学中日联谊医院确诊),手术中切除的新鲜组织作为研究对象，同时留取与其配对的癌旁组织(距离取材的癌组织10 cm以上)。以上取材离体后液氮速冻，置-80℃保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

测序级胰蛋白酶、DNA酶、RNA酶、考马斯亮蓝-G250均购于西格玛(美国)公司，蛋白定量试剂盒、IAA(购于Bio-Rad公司)，DTT，FA，尿素，TMED。液相色谱分析仪(Agilent公司)，LTQ XL离子阱质谱仪(Thermo Fisher公司)，UV-2000型分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1总蛋白的提取、蛋白浓度测定将冻存的待测组织样本取出，充分研磨至匀浆。在4℃，12 000 g条件下离心，1 h，留取上清液待用。考马斯亮蓝染色后用UV-2000型分光光度计于590 nm处进行比色，从而计算出样本蛋白的浓度。

1.3.2组织蛋白水解多肽混合物的制备将样本从冰箱中取出置于室温下平衡后，为降低尿素在样本中的浓度，应用NH4HCO3稀释。加入一定量DTT后充分混匀，使终浓度调至20 mmol/L，置56℃，避光1 h。待上述操作完成后降至室温，取1 mol/L IAM 适量，使终浓度调至50 mmol/L，置室温，避光30 min。测序级胰酶按胰酶与蛋白质1:50的比例加入，而后置于37℃水浴箱中，过夜，酶切产物(真空抽干)，保存于-80℃条件下。

1.3.3液质联用技术分析待测样本用FA溶解后取50 μg上样，洗脱的多肽用LTQXL质谱仪进行检测，选取合适核质比范围，以数据依赖的方式进行质谱扫描。所得质谱图应用Bio works3.3.1SP1软件进行分析。

1.3.4Western Blot 该方法验证目的蛋白FGG在癌组织以及癌旁组织中的表达情况。所用FGG单克隆抗体为ABGENT公司(美国)，内参抗体：GAPDH。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 液质联用技术结果分析

配对样本中蛋白质谱图数差值≥72，并且比值≥1时，可以说蛋白质丰度有差异。按此标准，得出结直肠癌组织与其癌旁组织的差异蛋白44个，其中21个表达上调，23个表达下调。FGG质谱图见图1。

图1 FGG质谱图

2.2 Western blot

用Western blot试验印证了FGG在结直肠癌及其癌旁组织中的表达水平，结果显示FGG在结直肠癌中的表达水平明显高于与其配对的癌旁组织，如图2。

3 讨论

结直肠癌的发病率在近几年里居高不下，与其他一些癌症相似，发病具有隐匿性，一经确诊已接近中晚期。因此，寻找到可以作为该病病情监测以及疗效预测的肿瘤标志物成为了目前亟待解决的问题，进而达到提高生存率以及有效治疗的目的。本文通过对癌组织以及癌旁组织中蛋白表达情况进行分析比对，从而为临床诊断提供新的肿瘤标志物。Garcia[3]等人通过体外证明，肿瘤细胞可以产生FG。Zhang Xiang[4]等人证实，FGG在原发性肝癌组织中表达较相应的癌旁组织比较明显增加。细胞内FGG的表达上调与血管侵犯增加、卫星结节增多、TNM分期加重显著相关，FGG表达增强的肝癌患者复发率较高。纤维蛋白原在凝血、纤维蛋白溶解、细胞和基质的相互作用、炎症和伤口愈合中起着重要的作用[5]。许多研究表明，在恶性肿瘤患者中高纤维蛋白原血症可以作为预后因子[6]，并且与肿瘤的生长、侵袭转移以及血管生成有关[7-9]。Yokoyama[10]等人发现FGG的C末端区域作为纤维蛋白原的主要整合素结合位点参与血栓形成、血管生成和炎症过程。Mark Bloomston[11]等人研究发现，在胰腺癌中FGG过表达，采用免疫组织化学、蛋白组学以及血清酶学等方法的验证，其被视为潜在的肿瘤标志物[12]。KinoshitaA[13]等人研究发现，肝细胞癌中FGG的mRNA水平增高，并且血浆纤维蛋白原水平随着临床分期的增加而增加。有学者通过定量蛋白组学以及MALDI-TOF MS的研究表明，FGG与子宫肌瘤的发生和发展有关，可能成为该病诊断的标志物之一[14]。