狗头枣果实生长过程中保护酶活性变化规律

白永宏，赵赞延，王亚洁，李金忆，赵 锋，陈国梁，3

（1.延安职业技术学院，陕西延安716000；2.延安大学生命科学学院，陕西延安716000；3.陕西省红枣重点实验室，陕西延安716000）

红枣（Zizyphus jujube Mill）属于鼠李科枣属植物，为我国独有树种，至今已有超过3 000 a 的栽培历史[1]。红枣富含多种矿物质元素，营养价值高，适口性好，是百果之王，深受广大消费者青睐。然而，枣成熟期短而且集中，又极不耐贮运，产区常常出现成批鲜枣腐烂的情况。在自然状态下，鲜枣采收后不易保鲜、不耐贮藏，果肉很快软化变褐，常温下容易代谢失常、腐烂和失水，常常会出现表面皱缩、果肉组织坏死、积累大量的乙醇等有害物质，枣果实的Vc 几乎全被破坏，大大降低了枣果的营养价值，缩短了鲜枣市场的货架期[2]，极大地限制了我国红枣产业的发展。

本试验研究了狗头枣果实在枣果实生长过程中超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化氢酶（CAT）3 种保护酶活性，探讨这3 种酶在枣果实成熟软化中的作用及其相互关系，以期找到影响枣果实成熟软化的关键酶类，掌握相关酶对枣果实生长发育、成熟软化等机制的作用及规律，进一步阐明枣果实成熟软化与衰老的酶学调控机制，更好地控制枣果实成熟软化进程，提高耐贮性，为改善果实品质和完善贮藏保鲜技术提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究所用狗头枣果实采自延安市宝塔区石家畔村。2018 年8 月5 日至9 月19 日每15 d 采样一次，9 月20 日至10 月10 日每7 d 采样一次。采样方法：随机采摘成熟度一致、大小均匀、无机械损伤和病虫害的狗头枣果实，用清水冲洗，当天用冰盒带回实验室，放入-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.2 试验方法

对狗头枣果实样品进行预处理：随机从超低温冰箱中取出每个时期的狗头枣果实各10 颗，分时期处理，分别去皮去核切成小块，混匀备用。

1.2.1 粗酶液的制备

1.2.1.1 SOD、CAT 粗酶液的制备 参考田昕等[3]的方法进行。称取预处理过的不同时期的枣果实各4.0 g，置于预冷研钵中，加入10 mL 预冷的50 mmol/L pH 值7.8 的PBS 提取液，冰浴研磨至匀浆。装入50 mL 离心管中，用20 mL 的PBS 冲洗研钵2 次，冲洗液亦转入离心管中，于4 ℃以10 000 r/min离心20 min，所得上清液即为粗酶液，冰浴保存，用于测定SOD、CAT 活性，测定时取适量酶液稀释5 倍。

1.2.1.2 APX 粗酶液的制备 参考张亚宏等[4]的方法进行。称取预处理过的不同时期的枣果实各2.0 g，加入10 mL 预冷的50 mmol/L pH 值7.0 的PBS 提取液，冰浴研磨至匀浆，转入50 mL 的离心管中，再加入10 mL 的PBS 冲洗研钵，冲洗液亦转入离心管中，于4 ℃条件下15 000 g 离心15 min，收集所得上清液即为粗酶液，冰浴保存。

1.2.2 酶活性的测定

1.2.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 采用NBT 光化还原法[5]进行。试管中分别加入50 mmol/L的PBS 4.05 mL、220 mmol/L 的Met 溶液0.3 mL、1.25 mmol/L 的NBT 溶液0.3 mL、33 μmol/L 的核黄素溶液0.3 mL 和SOD 粗酶液0.05 mL（对照以缓冲液代替）。将上述试剂混匀后，置于4 000 lx 的光照培养箱中反应20 min。反应结束后，用黑布罩上试管，终止反应。最后在560 nm 波长下测定OD 值，以不照光的对照管作参比，分别测定其他各管的OD 值。以每克样品抑制NBT 光化还原50%为一个酶活力单位（U）。

1.2.2.2 过氧化氢酶（CAT）的活性测定 参考张以顺等[6]的方法进行。取CAT 粗酶液0.2 mL、pH 值7.8 的PBS 1.5 mL、蒸馏水1 mL，在25 ℃水浴锅中预热10 min 后，加入0.1 mol/L 的H2O20.3 mL，每加完一管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，在240 nm 波长下测定OD 值，每隔1 min 读数1 次，共测4 min。以单位时间内（1 min）每克样品使OD240减少0.1 为1 个酶活力单位（U）。

1.2.2.3 抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性测定在张亚宏等[4]方法的基础上加以改进。在试管中加入磷酸缓冲液1.8 mL、AsA 溶液0.6 mL、APX 粗酶液0.1 mL、蒸馏水0.9 mL。在25 ℃水浴锅中预热10 min，再加入H2O20.6 mL，启动反应，立即计时，并迅速倒入石英比色皿中，在290 nm 波长下测定OD 值，每隔1 min 读数一次，共测4 min，以单位时间（1 min）内每克样品使OD290变化0.1 定义为一个酶活力单位（U）。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2007 和Microsoft Power-Point 2007 软件对试验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 超氧化物歧化酶（SOD）的活性变化

表1 枣果实生长过程中3 种保护酶的活性

从表1 和图1 可以看出，枣果实幼果期超氧化物歧化酶（SOD）活性较高（411 U/g），到了青果期其活性急剧下降，低至186 U/g，从青果期到全红期其酶活性又上升了1 倍多，最高达到398 U/g，全红期后其酶活性快速下降到最小值129 U/g，在狗头枣果实生长过程中SOD 活性整体呈先大幅度下降、后缓慢上升再下降至最低点的变化趋势。其中，幼果期到青果期SOD 活性大幅度下降；泛红期到半红期，SOD 活性由257 U/g 增长到292 U/g，3 个生长阶段活性只增加了35 U/g；全红期到成熟期又呈现缓慢的下降趋势。超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内清除自由基的关键保护酶之一，SOD 可清除细胞内过量的活性氧[7]。从试验结果可知，SOD 在狗头枣果实生长过程中酶活性是多变的，没有规律。这可能与果实的生长环境密切相关，比如紫外线的影响，紫外线越强，超氧化物歧化酶的活性也就越强。

2.2 过氧化氢酶（CAT）活性的变化趋势

由表1 和图2 可知，在狗头枣果实生长过程中CAT 活性呈缓慢上升再缓慢下降的趋势，从幼果期（94 U/（g·min））到青果期（129 U/（g·min））、泛红期（141 U/（g·min））、半红期（169 U/（g·min））、全红期（207 U/（g·min））4 个生长阶段一直呈缓慢上升趋势；从全红期开始，到成熟期（195 U/（g·min））、完熟期（146 U/（g·min））活性又下降。进一步分析可看出，相比其他相关酶类，过氧化氢酶（CAT）活性整体变化幅度小，其最大值与最小值之差为113 U/（g·min）。可以在一定程度上说明，过氧化氢酶在狗头枣生长过程中变化不大，对其生长生理影响不大。CAT 参与植物生长发育、逆境胁迫防御应答、氧化衰老等生理过程[8]，CAT 对狗头枣果实的保护在全红期最强，其他时期也具有一定的抗胁迫作用[9]。

2.3 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的变化趋势

由表1 和图3 可知，枣果实抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性在幼果期较低（57 U/（g·min）），从幼果期到泛红期含量几乎没有变化，从泛红期到成熟期活性快速增高到峰值192 U/（g·min），之后又稍有下降，至完熟期降为173 U/（g·min），在狗头枣果实生长过程中APX 活性整体呈上升趋势。如果将泛红期和完熟期视为偶然因素影响，那么整体来看，抗坏血酸过氧化物酶（APX）在狗头枣果实生长过程中呈缓慢上升趋势，即随着生长时期的推进酶活性越来越高。因为APX 参与植物生长发育和多种逆境胁迫的响应过程，所以可以认为，APX 随着狗头枣的生长，保护作用越来越强。

3 结论与讨论

超氧化物歧化酶（SOD）是一种含有金属的抗氧化酶。它第一个在活性氧清除系统中发挥催化作用[10]，催化超氧阴离子（·O2-）进行歧化反应生成·O2-和H2O2，其作用是避免O2-自由基对细胞膜产生过氧化作用[11]。本研究中，枣果实的幼果期SOD 活性最高达到411 U/g，活性很高，这可能与细胞新陈代谢旺盛、细胞增殖分化快、细胞产生的活性氧多有关。青果期SOD 活性数值低至186 U/g，下降幅度较大，可能是SOD 与超氧阴离子自由基（·O2-）发生歧化反应，导致了·O2-浓度的下降，产生了大量的H2O2，造成SOD 的活性受到了较强抑制；青果期后期，由于APX 和CAT 的活性逐渐上升，清除了部分H2O2，导致抑制作用减弱，SOD 的活性又逐渐升高，到全红期升至398 U/g；全红期后，SOD 的活性下降较为显著。这与赤小豆子叶[12]、苹果果实[13]的研究结果是一致的。枣果实在成熟期后，由于逐渐成熟软化，果实细胞衰老，细胞功能开始衰退，代谢产生的O2-积累得越来越多，达到一定程度后就会严重伤害细胞，使细胞SOD 基因表达减少，因此，SOD 的活性也就降低。

过氧化氢酶（CAT）是生物体内重要的清除H2O2的重要酶类之一，SOD 的产物是CAT 催化的底物[14]。CAT 催化H2O2的分解，生成H2O 和O2，阻断O2在铁螯合物作用下与H2O2反应，生成对植物有害的·OH[15]。因此，在活性氧清除系统中，CAT 是第2 类保护酶之一。在婆枣、龙山贡枣[3]、杜梨[16]等的研究中发现，枣果实生长发育过程中CAT 的活性变化有2 种类型，一种是升—降，另一种是降—升—降。在本研究中，枣果实的活性变化呈升—降类型，属于单峰趋势。在全红期，过氧化氢酶（CAT）出现活性达到峰值207 U/（g·min），之后其活性呈现较显著下降趋势，与婆枣、龙山贡枣的研究结果相似，都在枣果实成熟期前后出现活性峰值。这种变化趋势适应了枣果实成熟过程的生理变化，CAT活性的增高，活性氧的水平降低，保证了枣果实的生长发育正常进行，在枣果实发育成熟过程中发挥了重要的促进作用。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）是叶绿体中专一性地清除H2O2的酶，参与活性氧清除系统的第2 步反应，催化AsA 与H2O2发生氧化反应，生成单脱氢抗坏血酸（MDAsA）[17]。高等植物中有胞质型和叶绿体型2 种类型的APX[18]。烟草[19]、大麦[20]等植物的叶片中含有的APX 活性较高，而本研究中，枣果实APX活性水平总体较低，幼果期较低（57 U/（g·min）），成熟期达到峰值（192 U/（g·min）），这可能与其叶绿体的含量相关。在植物细胞内，AsA 的氧化分解主要由APX 和抗坏血酸氧化酶（AAO）催化[21]。随着枣果实的发育成熟，AsA 的含量也逐渐升高，储藏过程中细胞衰老，APX 的底物AsA 减少，完熟期后APX活性随之下降，可能与专一性的底物AsA 变化有关。

综合来看，枣果实生长过程中3 种保护酶活性的变化趋势与成熟衰老密切相关。SOD 是成熟衰老过程中的关键酶，其参与清除活性氧的第1 步反应。CAT 和APX 参与活性氧清除的第2 步反应，CAT 是生物体内重要的清除H2O2关键酶之一，APX 是清除叶绿体中H2O2的关键酶。SOD、CAT 和APX 这3 种保护酶协同清除氧自由基，促进枣果实的生长成熟。由此可推出，适当提高枣成熟期枣果实的3 种保护酶活性，可以延长枣果实的贮藏时间。