小麦-中间偃麦草代换系CH188 分子细胞学鉴定

罗小军，乔麟轶，李 欣，郭慧娟，阎晓涛，张树伟，常利芳，闫金龙，畅志坚，张晓军

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，作物遗传与分子改良山西省重点实验室，山西省主要农作物种质创新与分子育种重点科技创新平台，山西太原030031；3.山西省农业科学院谷子研究所，山西长治046011）

中间偃麦草（Thinopyrum intermedium，2n＝42）是禾本科多年生植物，是普通小麦近缘物种之一，它根系发达，耐寒性极强，免疫白粉、条锈、叶锈、秆锈等多种病害，并且有较强的耐盐碱、耐旱和耐低温性，再生性好、适应性广等特性，是小麦遗传改良中重要的三级基因源[1-3]。通过远缘杂交技术将中间偃麦草中优良基因导入小麦基因组中，选育和创造出人类需要的种质资源，同时对小麦优质、高产、抗病、抗逆等遗传改良将起到积极的促进作用[3]。孙善澄[4]采用有性杂交、连续回交和后代定向选择的方法，利用小麦和中间偃麦草选育出了中1、中2、中3、中4、中5 等5 个农艺性状优良的八倍体小偃麦新物种小麦-中间偃麦草部分双二倍体，具有高抗条锈、叶锈、秆锈等优良性状，其中，中4、中5 高抗小麦黄矮病。BAO 等[5]从普通小麦与中间偃麦草杂种后代中选育出了TE253 和TE257 等10 个TE系列，可能携带有不同的优良基因八倍体小偃麦。区别于亲本，八倍体小偃麦表现出茎秆粗壮，穗长优于主栽品种，结实率高、穗粒数多等优良农艺性状。培育小麦-中间偃麦草的双二倍体及部分双二倍体，并以这些双二倍体为桥梁创制与小麦亲缘关系更近的异附加系、异代换系和易位系等，是克服直接远缘杂交困难、杂种不育和杂种后代疯狂分离的有效手段。CHANG 等[6]利用普通小麦与中间偃麦草杂交获得了TAI7044、TAI7045、TAI7047、TAI8335 等多个八倍体小偃麦，并用这些八倍体小偃麦作为桥梁亲本，继续与小麦进行杂交、回交，选育出了CHadd7001、CHadd7002，丰富了小麦的遗传资源，也是中间偃麦草有用基因向小麦转移的重要载体。

本研究以八倍体小偃麦TAI7047 作为母本与普通小麦杂交，回交育成的高代新品系CH188 进行农艺性状、细胞学和分子标记综合鉴定，确定其优良农艺性状以及导入小麦基因组中的外源染色体，为后续鉴定染色体组成、抗病性、抗逆性，利用该小麦近缘种质资源提供重要信息。

1 材料和方法

1.1 试验材料

TAI7047、CH188 由山西省农业科学院作物科学研究所选育。TAI7047 由畅志坚等育成，源于普通小麦与中间偃麦草杂交后代的八倍体小偃麦新类型，TAI7047 的系谱为太原768/中间偃麦草//系76（64）。CH188 为普通小麦晋太170 与TAI7047 杂交，回交后选育的高代稳定品系。晋太170 为国审优质强筋小麦品种，由温辉芹等[7]提供。中国春为分子标记的对照组。

1.2 试验方法

1.2.1 农艺性状调查 2018—2019 年将TAI7047、CH188、晋太170 和中间偃麦草在山西省农业科学院作物科学研究所创新基地日光温室进行播种，每份种3 行，行长150 cm，行宽20 cm，每行20 粒，待材料成熟后进行田间农艺性状的调查，从每份材料中抽取10 个单株，测量株高、穗长、每穗粒数、小穗数、千粒质量。

1.2.2 细胞学鉴定 根尖有丝分裂中期染色体制备参考文献[8]。将10 株小麦-中间偃麦草异代换系CH188 材料，编号为1～10，每单株选取10 粒种子进行根尖细胞有丝分裂染色体中期数目的观察，步骤如下：将5 粒种子放在蘸有水的滤纸上，在24 ℃下发根，等种子露白在4 ℃冰箱处理24 h 后置于24 ℃，发育到根尖长到1.0～1.5 cm，剪取1 cm长根尖，放在管壁喷有水的离心管中，并置于冰中，然后在0.9 MPa N2O 中处理2 h 后，把根尖放在90%冰醋酸（保证整个根尖浸没其中）10 min 后，用蒸馏水洗涤3 次，吸水纸吸干根尖后，把根尖放在果胶酶和纤维素酶中，37 ℃酶解50～60 min，然后用70%酒精洗涤2 次，无水酒精洗涤1次，用解剖针把根尖捣碎，用移液枪混匀并吸取6.5 μL 于载玻片上方滴片，15 min 后在在相差显微镜镜下观察中期染色体分裂相，选择细胞染色体完整且分散均匀的片子，记录染色体的分散情况和数目。

1.2.3 分子标记 试验材料剪根后栽种于花盆内，生长至三叶期时取其细嫩的叶片，利用CTAB 法[9]提取CH188、中间偃麦草、中国春总DNA。利用CTAB法提取总DNA。作物遗传与分子改良山西省重点实验室根据中间偃麦草的Contig 序列，开发并筛选出了160 对中间偃麦草第六同源群特异STS 标记[10]，以中间偃麦草、中国春（中国春为对照）、CH188 为DNA 模板进行PCR 扩增，PCR 反应体系为15 μL，包括7.5 μL Taq PCR Mix 预混液（生工生物工程（上海）股份有限公司，Order NO.B639295），2 μL 模板DNA（50 ng/μL），1.8 μLPrimers（50 ng/μL，生工生物工程（上海）股份有限公司合成），3.7 μL ddH2O。PCR 扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55～65 ℃（不同Primers 略有不同）退火30 s，72 ℃延伸25 s，共34 个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳条件为恒压220 V，50 min，硝酸银染色后显色照相并观察结果。

2 结果与分析

2.1 小麦-中间偃麦草代换系CH188 的主要农艺性状

由表1 可知，代换系CH188 株高为70.60 cm，穗长为14.60 cm，小穗数和穗粒数分别为28.30 个和55.4 粒，明显优于亲本晋太170 和TAI7047，经几年的种植鉴定，CH188 农艺性状比较稳定，较好的结合了亲本的优良性状。

表1 CH188、中间偃麦草、TAI7047、晋太170 主要农艺性状比较

2.2 小麦-中间偃麦草代换系CH188 的细胞学鉴定

对小麦-中间偃麦草代换系CH188 材料进行根尖细胞有丝分裂染色体中期数目的观察发现（图1、表2），每1 株小麦-中间偃麦草代换系CH188材料根尖细胞染色体数目平均数接近42 条，预测CH188 染色体数目恒定，为小麦-中间偃麦草代换系，结合CH188 有稳定的农艺性状，可以推测出CH188 属于稳定材料。

表2 CH188 材料根尖有丝分裂中期染色体的分散情况与数目

2.3 小麦-中间偃麦草代换系CH188 的分子标记

中间偃麦草第6 同源群Contig 序列开发了160个STS 标记，位于G6-Chr1、G6-Chr2、G6-Chr3染色体的STS 标记分别为58、59、43 个。利用这些STS标记对中间偃麦草、中国春、CH188 进行PCR扩增，结果显示（图2），只有G6-Chr2 染色体的STS标记在中间偃麦草、CH188中均扩增出与目标片段一致的条带，而在中国春中未扩增出该条带。位于G6-Chr2 染色体STS标记扩增出特异性条带的8个标记分别被命名为LD17-22、LD17-32、LD17-72、LD17-100、LD17-102、LD17-114、LD17-150、LD17-171。G6-Chr2 已被证实为中间偃麦草的6St 染色体[10]，结合田间农艺性状、细胞学鉴定的结果，可以推测小麦-中间偃麦草代换系CH188 为小麦的一对染色体被中间偃麦草6St 染色体替代。

3 结论与讨论

中间偃麦草是小麦外源基因利用较早，也较成功的物种之一，其染色体中优良基因一直是人们研究的重点。通过农艺性状调查可知，CH188 表现出的茎秆粗壮，小穗数、每穗粒数、千粒质量都优于主栽品种，后续经几年的种植鉴定，CH188 农艺性状比较稳定，较好地结合了亲本的优良性状。结合100 份CH188 材料观察根尖细胞有丝分裂中期数目为42 条，说明CH188 具有与普通小麦一致的染色体数目,细胞学稳定性强。

形态学具有鉴定操作简单、直观等优点，近年来，科研工作者把形态学方法作为鉴定和筛选新品种的首选方法[11-13]，但是形态学鉴定易受环境条件的影响，主观判断依赖于丰富的实践经验。分子标记技术的发展为其新种质材料的鉴定提供了新的发展方向，但迄今为止，中间偃麦草的全基因组数据尚未公布，其特异分子标记的筛选主要来自二倍体长穗偃麦草和拟鹅冠草[14-15]，以及部分利用PLUG 标记转化的EST-STS 或SCAR 标记[16-17]，对鉴定材料中中间偃麦草染色体片段存在较大的局限性。本研究基于中间偃麦草第六同源群Contig 序列开发的160 个STS 标记，其中，位于G6-Chr1、G6-Chr2、G6-Chr3 染色体的STS 标记分别为58、59、43 个[10]，利用这些标记在中间偃麦草、中国春、CH188 中扩增，只有G6-Chr2 染色体的STS 标记在中间偃麦草、CH188 中均扩增出与目标片段一致的条带，而在中国春中未扩增出该条带。在相关文献中也证实了G6-Chr2 为中间偃麦草的6St 染色体[8]，推测CH188是小麦中的一对染色体被中间偃麦草中的6St 替代的异代换系。小麦-中间偃麦草CH188 优良的农艺性状可以作为小麦遗传改良的优良资源加以利用，同时为下一步原位杂交技术验证确定染色体构成，深度分析鉴定抗病性、抗逆性提供有利资源。