小麦材料CH1532 抗白粉病基因的染色体定位

孔佳茜，郭慧娟，乔麟轶，李 欣，贾举庆，张树伟，常利芳，阎晓涛，任永康，畅志坚，张晓军

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院经济作物研究所，山西汾阳032200；3.山西省农业科学院作物科学研究所，作物遗传与分子改良山西省重点实验室，山西省主要农作物种质创新与分子育种重点科技创新平台，山西太原030031；4.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

白粉病是普遍发生于小麦各个生育阶段的一种世界性病害，可造成小麦减产及品质下降[1]。随着矮秆品种的普遍种植及氮肥的大量使用，白粉病的危害日趋严重[2]。推广品种中抗源狭窄、抗病基因单一的生产现状，极易引起白粉菌生理小种的变异，使抗病品种丧失抗性，是小麦生产的重大安全隐患[3]。

迄今为止，国内外已从65 个位点上鉴定出85 个抗白粉病基因（Pm1～Pm65）[4-5]，但在生产上应用的非常有限，大多数抗病基因已随着白粉菌的变异与扩展而失去抗性。因此，持续发掘与利用抗病资源，鉴定新的抗白粉病基因，并利用分子标记等技术进行抗白粉病基因聚合育种，增强现有品种的抗性，是小麦品种抗性改良的重大需求[6-7]。

CH1532 是通过远缘杂交选育的一个小麦新品系，系谱为：中8701//TAP8430/冀麦26，其中，TAP8430 为来源于长穗偃麦草的八倍体小偃麦[8]，中8701 和冀麦26 为普通小麦。CH1532 成株期对白粉病具有优良抗性，苗期对多个小种表现为免疫或高抗，对小麦品种的抗病改良具有重要价值。

本试验对CH1532 的白粉病抗性进行了遗传分析，并利用SNP 芯片对其抗病基因进行了初步定位，旨在为研究与利用该抗源提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

抗病亲本CH1532、感病亲本台长29 及其F1、F2、BC1和374 个F2∶3家系用于白粉病抗性鉴定。所用的白粉菌菌株为E09，来自中国农业科学院植物保护研究所，以幼苗活体繁殖的方法保存。感病对照为台长29。

1.2 抗病鉴定

试验材料的抗病鉴定采用苗期接种鉴定的方法。将用于苗期抗病鉴定的小麦材料播种于72 孔育苗盘中，每孔播5 粒种子，重复4 次。感病对照台长29 播种于育苗盘四角及中心位置。种植约7 d后，小麦幼苗长至一叶一心，采用扫抹的方法人工接种白粉菌，且控制温度为16～21 ℃，湿度65%左右，利于白粉菌生长。待对照台长29 完全感病时，即可进行抗病调查。采用0～4 级分级标准[9]进行记录，IT＝0，为免疫；IT＝0；为近免疫；IT＝1，为高抗；IT＝2，为中抗；IT＝3，为中感；IT＝4，为高感。

1.3 抗、感病池的构建及SNP 芯片扫描

取少量台长29/CH1532 的F2群体单株及亲本叶片置于2 mL 离心管中，液氮冷冻后在Scientz-48型高通量组织研磨器上将叶片打碎，利用CTAB 法[10]提取基因组DNA。根据F2及F2∶3家系抗病鉴定结果，采用分离群体分组分析法[11]分别选取25 株极抗（反应型为0 或0；）或极感（反应型为4）F2纯合单株，每株取等量DNA 混合成抗病池和感病池，进行iSelect 90K SNP 芯片扫描。

1.4 SNP 结果分析及染色体定位

根据SNP 芯片扫描结果，筛选出抗亲和感亲间具有多态性的SNP 标记，进一步筛选出在抗、感病池间具有多态性的SNP 标记，去除信号缺失的标记和等位位点为杂合型SNP 的标记。对获得的SNP标记进行分析，根据SNP 侧翼序列，在中国春小麦全基因组序列（IWGSC RefSeq v2.0）中进行Blast N比对，获得筛选到的多态性SNP 位点的染色体位置信息，并利用染色体画图软件MapInspect 进行作图，根据SNP 标记的富集区域确定抗病基因所在染色体位置。

2 结果与分析

2.1 抗病性遗传分析

利用国内白粉病优势菌株E09 对台长29、CH1532 及其F1、BC1、F2及F2∶3家系进行接种鉴定，结果表明，CH1532 对E09 表现为免疫，台长29 表现为高感，其正反交F1全部表现为免疫，与抗病亲本CH1532 表现一致；与台长29 回交的45 株BC1中有25 株表现为免疫或近免疫，20 株表现为高感，抗感比例符合1∶1（χ2＝0.556，P＝0.456），说明CH1532 中的抗白粉病基因为显性核基因。374 个F2单株中有289 个单株表现为抗病（IT＝0～2），85 个单株表现为感病（IT＝3～4），抗感分离比例符合3∶1（χ2＝1.030，P＝0.310）（表1）。374 个F2∶3家系中，纯合抗病的有96 个，抗、感分离的有190 个，纯合感病的有88 个，抗感分离比例符合1∶2∶1（χ2＝0.439，P＝0.803）。因此推断，CH1532 的白粉病抗性受1 对显性核基因控制，暂命名为PmCH1532。

表1 台长29/CH1532 组合对白粉菌株E09 的抗性反应

2.2 SNP 结果分析及抗病基因的染色体定位

SNP 芯片扫描结果表明，在iSelect 90K SNP 芯片的81 587 个标记位点中，有7 870 个SNP 在抗、感亲本间具有多态性，占总标记数的9.65%；其中，有358 个SNP 在抗、感病池间具有多态性，占总标记数的0.44%；进一步去除信号缺失或等位位点为杂合型SNP 的标记，共获得89 个多态性SNP 标记。

根据NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的中国春小麦全基因组序列（IWGSC RefSeq v2.0），对89 个多态性SNP 标记的侧翼序列进行Blast N比对，获得其所在染色体位置信息。从图1 可以看出，多态性SNP 分布于小麦的14 条染色体上，其中，69 个位于小麦第2 同源群的3 条染色体上，占总数的77.5%，其余染色体上均为零星分布。而位于2A、2B、2D 染色体上的标记分别为14、11、44 个，分别占总数的15.7%、12.4%和49.4%。根据MapInspect 软件进行染色体作图，可以看出，SNP 标记在2A 和2B 染色体上分布较少，而在2D 染色体上多且分布集中（图2）。因此，推测抗白粉病基因Pm－CH1532 位于2D 染色体长臂的末端。

3 结论与讨论

单碱基多态性标记（Single nucleotide polymorphism，SNP），是随着测序技术和基因芯片技术发展起来的第3 代分子标记[12]，具有密度高、位点丰富、遗传稳定性好及分析自动化等优势，已在生物、农学、医学、进化等领域得到了广泛应用[13-14]。目前，已开发出多款小麦SNP 芯片，包括9K、35K、55K、90K、660K 和820K 等，用于小麦连锁图谱构建、QTL 定位、遗传变异检测等研究[15-17]，但在小麦新基因发掘与定位上应用较少。吴秋红等[18]利用90K SNP 芯片对河南省36 个小麦新品系进行了抗白粉病基因的规模化批量定位，证实了90K SNP 芯片在小麦基因分子标记定位方面的应用潜力。本研究采用其方法对小麦新品系CH1532 的抗白粉病基因进行了定位，结果表明，多态性SNP 富集于小麦第2 同源群的3 条染色体上，其中，位于Chr.2A 的有14 个，位于Chr.2B 的有11 个，位于Chr.2D 的有44 个。位于Chr.2D 的多态性SNP 显著多于Chr.2A 和Chr.2B，且在染色体上的分布更为集中，主要富集于2D 染色体635.60～650.32 Mb 区间。根据台长29/CH1532 遗传群体对白粉菌株E09 反应型的分离规律，CH1532 中仅含有1 对抗白粉病基因，因此，推测其所含有的抗白粉病基因PmCH1532 位于2D 染色体长臂的末端。有部分多态性SNP 分布于Chr.2A 和Chr.2B 上，可能是因为小麦的A、B、D 基因组之间存在较高的同源性[19]，其序列也较为相似，导致该SNP 的识别序列存在于在2 个或3 个基因组中，这些SNP 侧翼序列的Blast N 比对结果也证明了这一点。

小麦白粉病是一种小种专化型真菌病害[20]，由于白粉菌繁殖、适应能力强，变异快，小种复杂多样，极易引起抗病基因失效[21]，因此，持续挖掘新的抗病基因是防治白粉病危害的一项长期任务。迄今，小麦上已定位了85 个抗白粉病基因，分布于除3D、4D、5A 之外的其他18 条染色体上[22]。2D 染色体上存在2 个抗白粉病基因Pm43[23]和Pm58[24]，而Pm43 与本研究定位的PmCH1532 都位于2D 染色体长臂上，Pm58 则位于2D 染色体短臂上。根据对PmCH1532 与Pm43 进行的分小种接种鉴定结果，13 个白粉菌株中，它们对5 个菌株的抗性反应明显不同，因此，推测PmCH1532 是一个与Pm43 不同的新基因。本研究的下一步工作就是在SNP 芯片染色体定位的基础上，开发SSR 或KASP 标记，对PmCH1532 进行精确定位，获得该基因的精细图谱和连锁标记，以期为该基因在分子育种上的高效利用提供技术支撑。