青麦仁冻藏期内菌相分析及优势菌的分离鉴定

高玲玲，张康逸，何梦影，康志敏，温青玉，赵 迪

（河南省农业科学院农副产品加工研究中心，河南 郑州 450002）

青麦仁是指在乳熟后期、蜡熟期收获的小麦粒，此时期的麦仁虽已饱满但尚未成熟，呈浅青色或碧绿色。与成熟小麦相比，青麦仁具有独特的口味和特殊的香气，且其含有丰富的蛋白质、膳食纤维和α、β两种淀粉酶，具有帮助人体消化、降低血糖的功能[1-2]，深受消费者喜爱。近年来，随着人民生活水平的提高和膳食结构的改善，青麦仁市场需求量逐年增加，市场前景广阔。

一般情况下，小麦安全贮藏的含水量为12%~14%[3]。而青麦仁季节性强、收获期短、含水量高，不适宜常温贮藏。速冻能较好地保持其原有的色泽、香气及营养价值[4]，是鲜食谷物类产品加工和贮藏的重要方式之一[5-6]。但由于青麦仁营养丰富，水分活度较高，在收获后进行加工和冷冻贮藏过程中，一旦条件适宜其残留的微生物就会迅速生长繁殖，导致青麦仁腐败，产生诸如色泽、风味的改变，甚至营养成分被破坏等不同程度的品质问题[7-9]。因此，对速冻青麦仁中的菌相进行分析以及探讨引起青麦仁腐败变质的优势微生物的种类、数量等，不仅能够了解和掌握速冻青麦仁加工与速冻过程中的优势菌群，为青麦仁防腐抑菌试验提供目标菌，同时也可以为青麦仁腐败变质机制的分析和腐败菌控制措施的制定提供理论依据。

经研究发现，食品贮藏过程中易受细菌和霉菌的影响[10-11]。但关于冻藏期食品菌相的研究报道多集中在米面制品、肉类、奶类及水产等[12-15]，对于冻藏期内鲜食谷物菌相及优势菌的研究则未见报道。本研究以冻藏期内的青麦仁为对象，在传统分离方法的基础上，分析速冻青麦仁的菌相，并结合16S rDNA对优势菌株进行鉴定，研究青麦仁冻藏期内优势菌株出现的可能性，对青麦仁贮藏保鲜、货架期预测及生物控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

贮藏于-20℃的速冻青麦仁：由本实验室提供。

PCA培养基、孟加拉红培养基、改良MC培养基、PDA培养基、YNA培养基、NA培养基、明胶培养基、LB培养基、蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、琼脂、硫酸镁、碳酸钙，购于北京奥博星生物技术有限公司；磷酸二氢钾、氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇，购于天津市科密欧化学试剂开发中心；DNA纯化试剂盒，购于北京百泰克生物技术有限公司；引物合成，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备

SPX-250B-Z型生化培养箱，SW-CJ-1bu型洁净工作台，YXQ-LS-50S11型高压灭菌锅，HNY-2102C型恒温培养振荡器，BCD-202TD型冰箱，XSP-BM-2MC型显微镜，HH-S2型恒温水浴槽，JB/T5374型电子天平，ABI-2720型PCR仪。

1.2 方法

利用传统微生物培养法和菌落PCR技术进行青麦仁冻藏期内微生物种类及优势菌的分析。

1.2.1 样品的预处理

将贮藏于-20℃的青麦仁取出后在无菌超净台内分装成10 g/份的样品后立即进行各项指标测定，所用器具均经过高温杀菌。

1.2.2 菌相分析

利用选择性培养基对速冻青麦仁中的细菌、乳酸菌、芽孢杆菌、霉菌酵母菌进行平板计数，培养基和培养条件见表1。

表1 不同菌相的选择性培养基的培养条件Table 1 Incubation conditions and selective media for different microflora

1.2.2.1 速冻青麦仁菌相的分离纯化

称取青麦仁10 g，加入90 mL无菌水，用无菌研钵研成匀浆。将青麦仁匀浆按比例10-3、10-4、10-5的稀释梯度进行稀释，用移液枪分别吸取1 mL悬液至各选择性培养基中，用涂布器涂布均匀后，每个稀释度重复3次，置于28℃恒温培养箱中培养48 h后，取适当稀释度的琼脂平板计算菌落总数。

在培养基上选取典型菌落在相应的选择性培养基上反复划线分离纯化后进行培养，将纯化好的单菌落制成15%甘油菌悬液，放入-80℃冰箱保存。

1.2.2.2 菌相基本形态特征

对分离纯化后的单个细菌的菌落形态（包括菌落颜色、菌落形状、菌落隆起度、菌落边缘、菌落透明度、表面形态、质地等）进行观察、记录[16]。

1.2.3 优势微生物的鉴定

1.2.3.1 生理生化试验

参考东秀珠等[17]的方法对优势微生物进行生理生化鉴定。

1.2.3.2 16S rDNA序列测定

将优势菌株按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明提取细菌DNA，细菌扩增所用的引物为通用引物27f和 1492r(1)。上游引物 27f：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′，下游引物 1492(1)：5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′。PCR扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30个循环，72℃延伸10 min，PCR产物经电泳检测后送上海生工测序。将测序的拼接结果在NCBI网站上利用Blast软件在GenBank数据库中进行同源性分析。采用MEGA4.0软件依据邻位相邻法对所有分离鉴定菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行分析比较，绘出系统进化树。

1.2.4 数据处理

采用Excel软件进行数据分析与制图。

2 结果与分析

2.1 速冻青麦仁的菌相分析

在一种或一类食品中，内在各种微生物之间相互竞争与拮抗、互利共生或偏利共生以适应各自环境条件而共存于食品内环境中，形成了特定微生物群体分布，称为食品微生物菌相[18]。青麦仁由于含水量较成熟小麦高，冻藏过程中温度波动易受微生物污染使其品质降低，而导致谷物变质的微生物主要是细菌和霉菌[19-20]。因此，本研究取贮藏于-20℃冰箱的青麦仁，分别采用PCA培养基、CFC培养基、改良MC培养基和孟加拉红培养基分析速冻青麦仁中微生物菌群基本构相。

通过对速冻青麦仁菌相分析（图1）可知：在青麦仁冻藏期间，细菌为主要菌群，其中细菌总数为3.76 lg(CFU/g)。我国尚无对于速冻青麦仁的卫生标准，一般采用速冻面米制品的卫生标准[21]作为标准。GB 19295—2011[21]中规定，速冻面米制品的菌落总数不应超过4lg(CFU/g)，因此，鲜食青麦仁可通过速冻的方式贮藏。霉菌酵母菌相对较少，为0.56 lg(CFU/g)。这些微生物即青麦仁冻藏过程中的初始菌相，是解冻后引起青麦仁发生腐败的主要原因。

2.2 菌相基本形态特征

通过对速冻青麦仁中的微生物分离纯化，将形态特征一致的归为一种，共得到细菌28种，真菌3种。各菌株形态特征如表2、表3所示。

2.3 优势微生物鉴定

细菌和霉菌只要环境适宜时，就能迅速繁殖，使某些菌群占优势，构成解冻后的青麦仁腐败时特征性菌相，造成其腐败变质。由于青麦仁中霉菌数量较细菌少，故从细菌中选取速冻青麦仁的优势微生物。分别统计28株细菌的菌落总数，按数量及所占比例选择前3株作为优势菌株进行鉴定，各菌株菌落总数如图2所示。

通过对速冻青麦仁细菌菌落总数测定并结合基本形态观察，选取3株优势微生物（QX-1、QX-4、QX-26）进行生理生化试验和16S rDNA序列测定。

2.3.1 优势微生物的生理生化鉴定

上述生理生化试验结果表明：QX-1、QX-26为革兰氏阴性菌，QX-4为革兰氏阳性菌。3株菌都为好氧菌，过氧化氢酶试验阳性，在过低或者过高的温度下都不适宜生长，在盐浓度低时生长旺盛，盐浓度过高时，菌株生长受到抑制。QX-1和QX-26能使明胶液化，QX-1和QX-4能使淀粉水解（表4）。

表4 优势微生物生理生化试验结果Table 4 Results of conventional physiological and biochemical tests of dominant microorganisms

2.3.2 16S rDNA序列测定

将分离得到的3株优势菌QX-1、QX-4和QX-26进行16S rDNA测序鉴定。提取这3株优势菌的基因组DNA，并以此为模板扩增16S rDNA，经电泳检测（图3），扩增的条带长度约1 400 bp。将PCR产物测序结果在NCBI中进行比对，并构建系统发育树（图4）。

由图4可知，所有序列与己知菌株的序列相似度均≥98%，说明鉴定结果可靠。经分子生物学鉴定后3株菌株分别为：QX-1为鞘氨醇单胞菌属、QX-4为微杆菌属、QX-26为不动杆菌属。

3 结论与讨论

采用菌落计数法测定速冻青麦仁中的菌落总数，其中细菌总数为3.76 lg(CFU/g)。由于我国尚无对速冻青麦仁的卫生标准，故采用GB 19295—2011[21]速冻面米制品卫生标准为参考。标准规定：速冻面米制品的菌落总数不应超过4 lg(CFU/g)。由此可知，速冻是鲜食青麦仁最佳贮藏方式之一。

大部分微生物在速冻贮藏条件下其生长繁殖因温度因素影响而受到抑制。微杆菌属及不动杆菌属菌株常见于冷冻食品中[22-24]，多为水产类及肉类，谷物类则少见报道。邓佳等[25]发现，微杆菌属为导致蓝莓腐烂的病原细菌，故猜测其有可能是速冻青麦仁中优势腐败菌之一，应对其进行进一步的研究。傅晓方等[26]从玉米中分离到的不动杆菌具有固氮酶活性和产吲哚乙酸（IAA）、降解有机磷能力，且可促进小麦幼苗生长、降解玉米赤霉稀酮[27]。鞘氨醇单胞菌是一类丰富的新型微生物资源，可用于芳香化合物的生物降解[28]，该属菌株凭借自身的高代谢能力与多功能的生理特性，在环境保护及工业生产方面具有巨大的应用潜力。孙建光等[29]在玉米及芹菜中发现内生鞘氨醇单胞菌，而本试验中分离到的鞘氨醇单胞菌是青麦仁本身所具有的还是由于外界因素影响携带的尚有待进一步验证，其应用潜力也值得进一步开发利用。

本试验对冻藏期内青麦仁菌相进行分析可知，其细菌菌落总数为3.76 lg(CFU/g)。经分离纯化后得到特异性细菌28株，真菌3株，菌落基本形态观察及菌落总数计数得到速冻青麦仁中优势菌群3株，经生理生化鉴定及16S rDNA序列测定可知速冻青麦仁中的3株优势菌分别为：QX-1鞘氨醇单胞菌属、QX-4微杆菌属和QX-26不动杆菌属。