加味茵陈蒿汤影响Nrf2/HO-1信号通路抗大鼠皮肤光老化作用

陈绍斐，王 刚，刘会娟，王子雯，许孟月

（1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州， 450000；2.河南中医药大学，河南 郑州，450000）

皮肤老化是由内部和外部因素引起的，分为皮肤自然老化和光老化[1]。随着环境问题和人们生活习惯的改变，皮肤老化疾病的发生率逐渐上升，皮肤光老化不仅加速皮肤衰老，同时导致皮肤皱纹增多，皮肤干燥粗糙，还与皮肤癌的发生有着密切关系[2-4]。近年来传统中药对皮肤光老化的研究报道增多，研究发现加味茵陈蒿汤与皮肤抗炎相关[5]。本研究拟通过在动物模型基础上，开展加味茵陈蒿汤对皮肤光老化的防治作用，并探讨其作用机制。本研究通过UVA为光源的辐射大鼠背部，复制皮肤光老化大鼠模型，并对光老化动物模型进行中药加味茵陈蒿汤干预，检测各组大鼠皮肤中氧化应激和Nrf-2通路等指标，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组实验动物

SD大鼠36只，4周龄，随机分成4组（n=9），空白组（不经任何处理，NC）、模型组（脱毛器脱毛和紫外线照射，MC）、加味茵陈蒿汤低浓度组（脱毛器脱毛和紫外线照射及加味茵陈蒿汤15g/Kg/d干预，Experimental L）、加味茵陈蒿汤高浓度组（脱毛器脱毛和紫外线照射及加味茵陈蒿汤30g/Kg/d干预，Experimental H）。各组大鼠在普通级动物房内饲养，给予标准饲料、自由饮水。药物组每天给予一次中药灌胃，空白组、模型组每天给与一次相同容量生理盐水灌胃，各实验组均持续灌胃至试验结束。

1.2 实验仪器和试剂

紫外辐射仪（德国Waldmann）；电动剃毛器（中国飞利浦）；SDS-PAGE 试剂盒、ECL发光液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；半干转膜仪购自美国BIO-RAD公司。MDA试剂盒、CAT试剂盒、SOD试剂盒均购至北京博奥森。

1.3 光老化大鼠模型

UVA照射前将模型组、加味茵陈蒿汤低浓度组和加味茵陈蒿汤高浓度组大鼠背部右侧皮肤进行机械性脱毛，脱毛区面积约1.5×1.5cm2，以后每次照射前用电动脱毛器脱毛。将大鼠置于自制固定器后距UVA联合UVB光源10cm处进行照射，每天30min，其每天照射强度是4.5 J/cm2。持续照射10W，UVA总照射剂量达到文献报道的剂量。

1.4 中药干预

药物组成：茵陈蒿30g、栀子15g、大黄10g，青蒿10g、黄芩12g、生地15g、菊花15g、夏枯草15g，制备：方中药物量为60kg成人的一日量，先取茵陈蒿，加水10倍量浸泡1h，先煎40min，后加入其他药再煎15min，滤过取汁；药渣加水5倍量，煎煮20min，滤过取汁；合并两次药液，浓缩至适宜体积备用。

1.5 氧化应激指标和MDA测定

组织匀浆的制备：取大鼠背部紫外线诱导部位皮肤组织制成 10%组织匀浆，以 4000rpm 的速度离心10min，取上清液进行各指标测定。严格按照CAT、SOD、MDA试剂盒说明书操作，分别分光光度计比色，测各管吸光度 A 值，代入试剂盒说明书中公式，分别计算皮肤组织中CAT、SOD、MDA的含量并对比分析。

1.6 Western blot检测Nrf2和HO-1蛋白含量：

RIPA蛋白裂解液皮肤组织细胞进行冰上蛋白裂解30 min，提取总蛋白，以BCA法测定样品蛋白的浓度。以4：1的比例加入蛋白上样缓冲液，混匀，沸水浴变性5 min，离心取上清，取60 μg目的蛋白、蛋白Marker进行SDS-PAGE蛋白电泳。然后用PVDF进行转膜，2.5%的脱脂奶粉进行封闭，TBST洗涤，4℃条件下，将封闭后的PVDF膜放入1:1000倍稀释的一抗中反应过夜，以封闭液洗膜3次，每次5min，再在37℃下将PVDF膜转入1:2000倍稀释的二抗中反应2 h。于暗室内ECL试剂盒显影曝光：滴加化学发光剂显影，以凝胶成像系统采集图像。Quantity One 4.62图像分析软件进行条带灰度分析，Image J分析目的条带的灰度值，以β-actin为内参，检测目的蛋白的表达。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 加味茵陈蒿汤抑制皮肤光老化大鼠氧化应激

从表1结果分析可见，与NC组相比较，紫外线辐射诱导MC组皮肤组织CAT活性、SOD活性下降和MDA含量上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与MC组相比，加味茵陈蒿汤低浓度灌药组皮肤组织CAT活性、SOD活性下降和MDA含量升高，其中高浓度药物治疗效果较优（P＜0.05）。

2.2 加味茵陈蒿汤检测加味茵陈蒿汤抑制皮肤光老化大鼠皮肤组织Nrf2/HO-1信号通路

结果如图1和表2显示，其中NC组大鼠皮肤组织中Nrf2和HO-1蛋白表达分泌无变化，结果无显著性差异（P＞0.05）；与NC组相比较，紫外线辐射诱导MC组皮肤组织Nrf2和HO-1蛋白表达降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与MC组相比，加味茵陈蒿汤低浓度灌药组皮肤组织Nrf2和HO-1蛋白增多，并且高浓度药物较低浓度药物组具有明显的促进作用（P＜0.05）

表1 加味茵陈蒿汤对皮肤光老化大鼠皮肤组织中CAT活性、SOD活性和MDA含量的影响（±s，n=9）

表1 加味茵陈蒿汤对皮肤光老化大鼠皮肤组织中CAT活性、SOD活性和MDA含量的影响（±s，n=9）

注：与NC组比较，*P＜0.05；与MC组比较，# P＜0.05

图1 Western blot检测大鼠皮肤组织中p-Nrf2和HO-1蛋白表达（±s，n=9）

表2 加味茵陈蒿汤影响皮肤光老化大鼠皮肤组织中p-Nrf2和HO-1蛋白表达（±s，n=9）

表2 加味茵陈蒿汤影响皮肤光老化大鼠皮肤组织中p-Nrf2和HO-1蛋白表达（±s，n=9）

注：与NC组比较，*P＜0.05；与MC组比较，# P＜0.05

3 讨论

加味茵陈蒿汤组方中茵陈蒿、栀子、大黄主治湿热之证，具有清热利湿的功效，为君药，青蒿、黄芩、菊花清热解毒，可增强燥湿功效，为臣药，生地、夏枯草为使药，可养阴生津、散结消肿、活血化瘀，诸药合用，可共奏清热利湿之功效。王韵等[6]报道采用反相高效液相色谱法测定茵陈蒿汤成分，发现其含有滨蒿内酯、儿茶素、绿原酸、东莨菪内酯等多种成分。现代医学认为，茵陈蒿[7]可镇痛、解热、消炎，栀子[8]可消肿、镇静、抗炎，大黄[9]具有很强的抗氧化作用，能调节免疫、抗炎、止痛，青蒿[10]可降温镇痛，抑制细菌，黄芩[11]具有抗病毒、抗炎、抗氧化作用，生地具有清除自由基、抗炎作用，菊花[12]可保护肝功能、抗炎，夏枯草[13]可扩张血管，增加皮损位置血液供给，且可抗炎、抗菌、抗病毒、调节免疫。加味茵陈蒿汤配合穴位注射丹参注射液治疗痤疮，可明显改善患者病症，效果较好[5]。加味茵陈蒿汤对皮肤光老化的作用的报道目前较少。

皮肤光老化是属于外源性老化，其临床表现为皮肤粗糙、皱纹增多、皮肤老化弹性丧失、皮革样外观并常附有色素沉积；通常高暴露人群皮肤老化发生时间会提前，更易引发鳞状细胞癌、基底细胞癌等，严重威胁人类健康[4]。紫外线辐射皮肤组织诱导ROS大量积累，并导致炎症因子过度表达，降低细胞生长因子表达和促进MMPs的异常分泌，最终导致皮肤组织结构和功能性发生改变，多个抗炎抗氧化作用的药物对皮肤光老化具有明显的抑制作用，如灯盏花素[14]、玉屏风散[15]。氧化应激与皮肤光损伤的发病息息相关[16]。CAT是一种稳定的过氧化氢分解酶，皮肤抗氧化系统中重要的抗氧化酶[17]。SOD是机体抗氧化酶系统一个重要成员，可催化体内超氧自由基发生歧化反应，清除氧自由基，维持机体氧化与抗氧化系统的平衡[18]。本研究检测结果显示紫外线辐射大鼠皮肤组织中CAT活性、SOD活性下降，与MC组相比，加味茵陈蒿汤灌药大鼠皮肤组织CAT活性、SOD活性提升和抑制MDA含量。Nrf2是调节抗氧化应激反应的重要转录因子，正常生理状态下与Keap1偶联结合，亲电子物质或氧自由基可修饰Keap1的半胱氨酸，增加Nrf2的稳定性，并转入细胞核内结合抗氧化反应原件，提高抗氧化蛋白基因的转录与表达[19]。本研究显示，紫外线处理大鼠皮肤组织中HO-1蛋白和Nrf2磷酸化蛋白表达下降，与MC组相比，加味茵陈蒿汤灌药大鼠皮肤组织HO-1蛋白和Nrf2磷酸化蛋白表达含量升高。结合以上几项研究结果提示加味茵陈蒿汤不仅可以通过提高抗氧化酶类活性减少氧自由基的堆积，以及与自身所具有的清除自由基的协同作用而发挥抗光老化作用，而且还可通过抑制Nrf2的活化发挥其抗皮肤光老化的干预作用。

种种现象表明了日光损伤以及加味茵陈蒿汤对光老化损伤的保护作用可能与HO-1/Nrf2信号通路的激活有关。Nrf2有抑制调亡和促进凋亡基因表达的双重作用，那么如何调控表皮细胞向着有利于皮肤组织生存的方向发展是今后研究的重点。本实验研究加味茵陈蒿汤与HO-1/Nrf2信号通路的关系为光老化保护以及再修复作用机制的研究奠定了一定的基础，并可能为皮肤组织损伤再修复的治疗开辟新的途径。综上所述，加味茵陈蒿汤可抑制光老化皮肤组织氧化应激，增加HO-1蛋白和Nrf2磷酸化蛋白表达，为中医药在皮肤美容和抗老化的应用研究提供科学依据，可进行深入研究，阐述其作用机制。