FOXD1的表达与结肠癌患者临床病理特征及细胞生物学行为的关系研究

谢力，皈燕

川北医学院附属医院肿瘤科 四川南充 637000

结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，多发于中年以上男性，早期无明显症状，随疾病发展表现为便血、腹泻、便秘等[1]。结肠癌的病因目前尚不清楚，临床主要采用外科手术治疗，具有一定的临床疗效，但对于中晚期病灶广泛伴随远处转移的患者尚缺乏有效的治疗手段[2]。寻找新的肿瘤标识物评估结肠癌的病情发展和预后，分析其在结肠癌发生发展中的作用机制，对结肠癌的治疗具有重要作用。人转录因子叉头框1（humanforkheadboxD1，FOXD1）是FOX家族成员之一，研究显示[3-5]，FOXD1在乳腺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤等多种肿瘤均存在异常高表达，但其在结肠癌中的表达意义及作用机制目前尚不清楚。因此，本研究拟分析FOXD1在结肠癌组织中的表达水平及与患者临床病理特征、预后的关系，并探讨其对结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2014年1月至2015年12月72例在本院行结肠癌手术患者的结肠癌组织和对应的癌旁正常组织（距离癌组织边缘约3 cm）各一份，癌旁组织经术后病理组织学诊断为正常黏膜组织。所纳入患者术前均未接受放化疗治疗，并对治疗内容知情同意，未合并其他恶性肿瘤，未合并严重心脑血管、免疫系统或血液系统疾病，均无严重肝肾功能不全，具有术后3年随访有效资料。72例患者中，男性42例，女性30例；年龄40～80岁，平均年龄（60.35±8.79）岁；肿瘤直径≤5 cm者40例，＞5 cm者32例；肿瘤分化程度：高分化9例，中分化39例，低分化24例；TNM分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期23例，Ⅲ期25例，Ⅳ期10例；合并淋巴结转移35例，无淋巴结转移37例。患者术后进入随访，采用门诊及电话形式进行，每3～6个月一次，随访截止时间为2019年1月，随访记录患者随访时状态（存活、死亡或其他）等，72例患者均具有完整的术后3年生存随访资料。

1.2 材料与仪器

7500 RT-PCR系统购自于美国Applied Biosystems公司；凝胶成像系统（型号Gel Doc XR）购自于美国Bio-Rad公司；人结肠癌细胞SW1116购自美国典型物种保藏中心；FOXD1 shRNA质粒及对照Control-shRNA购自上海吉凯生物有限公司；细胞培养基RPMI-1640、胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司；MTT检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司；TUNEL检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；转染试剂、RT-PCR试剂盒均购自赛默飞世尔科技公司；Transwell小室、Matrigel基底膜，购自美国BD公司。FOXD1抗体、β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司。荧光显微镜（BX-2，日本OLYMPUS公司）；多功能酶标检测仪（iMark680，美国Bio-Rad公司）。

1.3 检测FOXD 1在结肠癌组织中的表达

取结肠癌组织和对应的癌旁组织匀浆后，采用RT-PCR测定两组细胞中FOXD1 mRNA的表达水平，循环阈值（Ct值）表示cDNA达到指数扩增所需的循环数，目的基因Ct值减去参照基因Ct值等于△Ct值，将△Ct值转化为表达量进行比较。Trizol法提取细胞总RNA，总RNA经反转录合成cDNA，进行实时定量PCR反应，以GAPDH作为内参，FOXD1 mRNA上游引物：5’-ACAACTAAGCCTTTTTGAGG-3’， 下 游 引 物 ： 5’-AAAAGTACACCAGACAAGTG-3’；内参GAPDH上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’，下游引物：5’-TTGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’。采用 Western blot检测组织中FOXD1蛋白的表达。使用细胞裂解液严格按照蛋白裂解步骤提取总蛋白，将50 μg提取的总蛋白样品经过SDS PAGE电泳转印至PVDF膜，随后加一抗（FOXD1，稀释比例为1:1 000）4℃下孵育过夜，最后加二抗（HRP标记的IgG，稀释比例为1:5 000）37℃下孵育2 h，ECL法显色。以β-actin为内参，采用凝胶成像分析软件分析蛋白条带灰度值。

1.4 沉默FOXD 1对SW1116细胞生物学行为的影响分析

1.4.1 细胞培养与转染 采用含10%热灭活胎牛血清的RPMI-1640培养液培养SW1116细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。根据FOXD1序列设计siRNA FOXD1（siRNA序列：5’-GCGAGATCTGCGAGTTCATCA-3’，上海生工合成）和siRNA Control序列（序列：5’-GGCAATTACAAAATTTGATCA-3’，上海生工合成），并构建至pGLV3载体。将培养细胞分为沉默FOXD1组和对照组，分别将Lipofectamine 2000脂质体与FOXD1 shRNA质粒、对照Control-shRNA混匀，按照转染试剂操作步骤进行转染，以正常细胞为对照，采用RT-PCR检测沉默效率达到92.16%。

1.4.2 转染效率 转染后48 h，测定采用RT-PCR和Western blot检测FOXD1的表达情况。每组均设置6个重复。

1.4.3 MTT法测定SW1116细胞增殖情况 取各组对数生长期SW1116细胞，将单个细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL含103个细胞，每组设6个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养，于0 h、24 h、48 h、72 h和96 h分别加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，培养4 h，弃MTT，150 μL DMSO作用30 min，采用酶标仪检测450 nm波长下的吸光度（OD值），绘制细胞增殖曲线。每组重复检测6次。

1.4.4 Transwell检测结肠癌SW1116细胞的侵袭力取100 μL稀释好的基质胶均匀覆盖于Transwell小室底部。取各组对数生长期SW1116细胞，用0.2%的胰蛋白酶进行消化，调整细胞浓度为2×105个/mL。取100 μL稀释好的细胞悬液加于上室，37℃、5%CO2条件下培养48 h，取出Transwell小室，甲醇固定30 min，质量分数为0.1%的结晶紫染色，显微镜下拍照、计数，共计数5个视野，取平均值。每组重复检测6次。

1.4.5 划痕实验检测结肠癌SW1116细胞的迁移力取各组对数生长期SW1116细胞接种到96孔板，常规培养，待细胞长满单层，弃去培养基，用灭菌的移液枪头在皿底划一直线，洗涤3次，常规培养，于显微镜下观察划痕处细胞生长情况，根据划痕宽度计算细胞迁移率。每组重复检测6次。

1.4.6 检测SW1116细胞的细胞凋亡情况 取各组对数生长期SW1116细胞，制作细胞涂片，严格按照TUNEL试剂盒说明操作染色。经4%多聚甲醛固定，加入含0.1%TritonX-100的PBS冰浴2 min，洗涤2次，加入50 μL TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min，加入100 μL打孔液，室温避光孵育10 min，加入100 μL DAPI，室温避光孵育10 min，洗涤3次，封片后置于荧光显微镜下进行观察。每组重复检测6次。

1. 5 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行分析。符合正态分布的计量资料以（）表示，采用t检验进行组间比较，符合偏态分布的数据采用M（QL，QU）表示，采用非参数检验进行比较。采用Graphpad prism 5软件进行生存分析，采用Kaplan-Meier曲线描述生存情况，分别以3年总生存率和3年无病生存率作为观察终点，采用Log-rank检验进行组间比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXD 1蛋白在结肠癌组织与癌旁正常组织中的表达

与癌旁正常组织相比，结肠癌组织中FOXD1蛋白和mRNA的表达量上调（均P＜0.05）。见图1、表1。

图 1FOXD 1蛋白在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达

表 1FOXD 1在结肠癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 FOXD 1 mRNA的表达与结肠癌患者临床病理特征之间的关系

FOXD1 mRNA的表达与结肠癌患者的年龄、性别、肿瘤直径无关（均P＞0.05），与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关（均P＜0.05）。见表2。

2.3 FOXD 1 mRNA的表达对结肠癌患者预后生存的影响

FOXD1 mRNA在结肠癌癌组织中的表达量为1.51（1.29，1.76），将患者分为FOXD1 mRNA高表达组（≥1.51）和FOXD1 mRNA低表达组（＜1.51），每组各36例。结肠癌癌组织中FOXD1 mRNA高表达患者3年总生存率和3年无病生存率均低于FOXD1 mRNA低表达患者（Log-rankχ2=4.385、4.567，P=0.036、0.033）。见图2。

2.4 结肠癌SW1116细胞的转染效果和增殖情况

细胞转染实验显示，与对照组相比，沉默FOXD1组SW1116细胞FOXD1的蛋白和mRNA表达量下降（P＜0.05），转染成功。MTT实验显示，FOXD1组各时间点的SW1116细胞数量均少于对照组（均P＜0.05）。见图3、表3。

2.5 各组SW1116细胞的侵袭力和迁移力情况

与对照组相比，沉默FOXD1组SW1116细胞的侵袭力和迁移率下降（均P＜0.05）。见图4、表4。

表 2 FOXD 1 mRNA的表达与结肠癌患者临床病理特征之间的关系

图 2 FOXD 1 mRNA的表达与结肠癌患者预后的关系

图 3SW1116细胞FOXD 1蛋白的表达和细胞增殖情况

表 3SW1116细胞转染效果

图 4 SW1116细胞的侵袭和迁移力（×400）

表 4 SW1116细胞的侵袭力和迁移率情况

2. 6 各组SW1116细胞的凋亡情况

沉默FOXD1组SW1116细胞凋亡率为（14.35±2.38）%，对照组为（5.76±0.76）%，两组比较，差异有统计学意义（t=8.422，P＜0.001）。见图5。

图 5SW1116细胞的凋亡情况（×400）

3 讨论

结肠癌治疗的关键在于早发现、早诊断和早期手术根治。寻找特异性的分子标识物用以辅助评估病情发展具有重要意义。FOXD1是近年来发现的与多种肿瘤的发生发展相关的转录因子，通过调控机体相关的信号通路，调节肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭等生物学行为[6]。肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移均为临床常用的评估结肠癌患者病情发展的指标，与患者的预后相关[7]。李恒爱等[8]分析了622例结直肠癌患者的生存资料，发现手术方式、TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移等均为影响患者预后生存的独立因素。Pan等[9]的研究显示，FOXD1的表达与结直肠癌患者的临床病理特征相关，其低表达患者具有更高的生存率。本研究中，FOXD1在结肠癌癌组织中表达量上调，且其mRNA表达量与结肠癌患者的肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关，提示FOXD1的异常高表达可能与结肠癌的发生发展有关，此外，FOXD1 mRNA高表达患者的3年总生存率和无病生存率下降，提示FOXD1可能对结直肠癌患者的预后评估具有一定的潜在指导价值。

研究显示，FOXD1同源蛋白FOXD3、FOXD4等均可通过多种信号通路调节大肠癌细胞的生物学行为，提示FOXD1可能通过某种机制参与调控结肠癌的发生发展[10-11]。肿瘤细胞的恶性增殖加速了癌症的发展，是影响患者预后的主要原因[12]。本研究中，沉默FOXD1后，结肠癌细胞的增殖活性下降，细胞凋亡率增加，提示FOXD1可能具有促进结肠癌细胞的增殖并抑制其凋亡的作用。肿瘤细胞的侵袭和迁移是肿瘤发生转移和扩散的基础，也是影响恶性肿瘤患者预后的主要原因[13]。Tao等[14]的研究显示，FOXD1可以促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移，促进其恶性生物学行为。Wu等[15]的研究显示，FOXD1可能通过调节RAC1B基因的表达，促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移。Gao等[16]的研究显示，FOXD1基因沉默后可以抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移，诱导凋亡，有望作为胶质瘤靶向治疗的新基因。本研究中，沉默FOXD1后，结肠癌细胞的侵袭和迁移能力下降，提示FOXD1可能通过调节结肠癌细胞的相关信号通路，促进结肠癌细胞的侵袭和迁移能力，促进结肠癌的远处转移，影响患者预后，与前述文献[13-16]内容相符。

综上所述，FOXD1在结肠癌癌组织中表达量上调，且其表达量与患者肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关，FOXD1 mRNA高表达患者的3年总生存率和无病生存率下降，沉默FOXD1基因后结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力受到抑制，细胞凋亡程度升高。本研究为FOXD1在结肠癌中的应用提供了一定的理论支持，但FOXD1抑制结肠癌细胞的恶性生物学行为的具体机制尚不清楚，有待于进一步深入研究。