大蒜鳞茎浸提液活性成分及对苹果炭疽病菌的抑制作用

祁高展，刘红娜，李贞子，龙玲，王明明

(西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

苹果炭疽病是由苹果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起的，是苹果生产中的主要病害之一。该病多发生在幼果期，具有潜伏侵染的特点，防治困难。目前，生产中多采用喷施化学药剂的方法防治，但效果不理想，且病菌容易产生耐药性，不符合现代农业生产的要求[1]。因此，开发新型天然杀菌剂用于苹果炭疽病的无害化防治就成为必然趋势。大蒜(AlliumsativmL.)是公认的天然植物广谱抗菌材料，在农业生产领域，已有关于大蒜提取物控制农产品病害的研究报道。周清等[2]报道大蒜素对辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici(syd.)Butl.)和辣椒疫病病菌(PhytophthoracapsiciLeonian.)具有抑制活性；程智慧等[3]发现不同质量浓度的大蒜鳞茎粗提物对黄瓜枯萎病菌(Fusariumaxysporum(Schl.)f.sp.CucumerinumOwen.)具有抑制作用；宋卫国等[4]报道，大蒜乙酸乙酯提取液和乙醇提取液对番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPer.)孢子萌发均具有抑制作用。但有关其具体的活性成分及各成分对苹果炭疽病菌抑菌作用的研究未见报道。本研究通过大蒜鳞茎浸提液中活性成分分析及其对苹果炭疽病抑菌作用的测定，为利用大蒜开发新型天然杀菌剂对苹果炭疽病进行无害化防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 材料 大蒜(AlliumsativumL.)为市售新鲜民乐紫皮蒜，由当地农贸市场购买；苹果炭疽病病原物由西北民族大学生命科学与工程学院实验室提供。活性成分化合物标准品由阿法埃莎(Alfa Aesar)公司购得，分别为二烯丙基一硫化物(DAS)纯度为98%；二烯丙基二硫化物(DADS)纯度为80%；二烯丙基三硫化物(DATS)纯度为80%；苯甲酸乙酯(ELB)纯度为99%；二甲基二硫醚(DMDS)纯度99%；邻苯二甲酸二丁酯(DBP)纯度98.5%。

1.1.2 仪器 3-16L型离心机( 德国SIGMA公司)；RV 10 digital FLEX型旋转蒸发仪 (德国IKA公司)；TRACE2000 GC-MS联用仪(美国Finnigan公司)；MPLFLN-BD型物镜(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 病原物培养 将病原物活化，在无菌条件下由斜面接种到PDA平板中，在25 ℃恒温培养箱中避光培养5 d，待菌落布满平板后，用打孔器在菌落边缘打取孔径为8 mm菌碟，转接在新的PDA培养基上，继续培养备用。

1.2.2 含化合物标准品培养基的制备 在无菌条件下，用甲醇分别将各化合物标准品配成质量浓度分别为5×103、1×104、2×105mg·mL-1的母液，将配好的母液和融化的PDA培养基按照体积比1∶100混合均匀后倒平板，制成质量浓度分别为50、100、200 mg·mL-1的带药平板，以加入等体积甲醇的PDA培养基作为空白对照。

1.2.3 大蒜鳞茎浸提液母液制备 参照廖静静等[5]的方法，取新鲜剥皮大蒜50 g，洗净消毒，置研钵中匀浆，加入100 mL无菌水浸提4 h，过滤，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，经无菌过滤器(0.2 μm)过滤，制成质量浓度为0.5 g·mL-1的母液，保存备用。母液用相同体积的二氯甲烷萃取3次，在旋转蒸发仪上旋蒸至干，加入1 mL二氯甲烷定容，待GC-MS检测。

1.2.4 大蒜鳞茎浸提液成分分析 用TRACE2000 GC-MS联用仪对方法1.2.3制备的母液进行化学成分分析。色谱条件：色谱柱为DB21(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；初始柱温为50 ℃，保持4 min，然后以5 ℃·min-1升温至250 ℃，保持5min；载气为氦气，流速为1 mL·min-1；进样口温度250 ℃，进样量1 μL。质谱条件：EI电子轰击源，电离能70 eV，离子源温度250 ℃，溶剂延迟4 min，全扫描。

1.2.5 不同质量浓度化合物标准品对病原物菌丝生长的抑制作用 选用方法1.2.1中生长良好的PDA培养基，在无菌条件下用打孔器在菌落边缘处打取直径为8 mm的菌饼，放置在方法1.2.2制备的含不同质量浓度标准物的PDA培养基中央，每处理3皿，以加入等体积甲醇的PDA培养基为空白对照(CK)，25 ℃避光培养，5 d后用十字交叉法量取菌落直径，取平均值计算抑菌率。

抑菌率=((CK平均菌落直径-处理平均菌落直径)/CK平均菌落直径)×100%。

1.2.6 不同质量浓度化合物标准品对病原物孢子萌发的抑制作用 参照孙广宇等[6]的方法，用无菌水将病原物孢子洗脱并稀释成106cfu·mL-1的孢子悬浮液，按1∶1体积比分别与不同质量浓度的化合物标准品溶液混和均匀，用移液枪移取30 μL混合液于载玻片上，将载玻片放入铺有滤纸的培养皿中，以无菌水和孢子悬浮液混合液为空白对照(CK)，25 ℃避光培养，24 h后在40倍物镜下(每个视野里35个孢子)(以孢子芽管的长度超过孢子直径的一半为已萌发孢子)，每处理重复3次，取平均值计算孢子萌发抑制率。

孢子萌发抑制率=((CK平均孢子萌发数-处理平均孢子萌发数)/CK平均孢子萌发数)×100%。

1.3 数据分析

大蒜鳞茎浸提液GC-MS分析所得图谱采用NIST(计算机检索谱库)确认各化学成分的名称，采用面积归一法[7]计算出各成分相对质量分数。

所得不同质量浓度化合物标准品对病原物菌丝生长和孢子萌发化感作用实验数据用Excell2003和DPS9.5软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 大蒜鳞茎浸提液活性成分分析

利用GC-MS检测到大蒜鳞茎浸提液中含有11种化学成分(图1和表1)。其中，二烯丙基二硫化物含量为20.28%，二烯丙基三硫化物含量为15.96%，二甲基二硫醚含量为5.28%，苯甲酸乙酯含量为2.78%，邻苯二甲酸二丁酯含量为2.48%，二烯丙基一硫化物含量为2.30%。其余化学成分含量较低，以含苯化合物和酯类化合物为主。

图1 大蒜鳞茎浸提液气相色谱图Fig.1 The gas chromatography of garlic bulb extract

表1 大蒜鳞茎浸提液活性成分Table 1 Active components of the garlic bulb extract

2.2 不同质量浓度化合物标准品对病原物菌丝生长的抑制作用

由表2可知，大蒜鳞茎浸提液的6种主要成分中，二烯丙基一硫化物、二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物、苯甲酸乙酯以及二甲基二硫醚对病原物菌丝生长具有抑制活性。其中，二烯丙基三硫化物和二甲基二硫醚抑制活性最强，两者在质量浓度为100 mg·mL-1时对病原物菌丝生长的抑制率均达到了100%；而邻苯二甲酸二丁酯则对病原物菌丝生长表现为低质量浓度促进和高质量浓度抑制作用。

2.3 不同质量浓度化合物标准品对病原物孢子萌发的抑制作用

不同质量浓度化合物标准品对病原物孢子萌发的抑制作用如表3所示。6种主要成分对病原物孢子萌发均具有抑制活性，其中二烯丙基三硫化物和二甲基二硫醚抑制活性最强，两者在质量浓度为200 mg·mL-1时对病原物孢子萌发的抑制率均达到了100%。

表2 不同质量浓度化合物标准品对病原物菌丝生长的抑制作用Table 2 Inhibition of different concentrations standard compounds on pathogen mycelial growth

注：表中DATS为二烯丙基三硫化物，DADS为二烯丙基二硫化物，DBP邻苯二甲酸二丁酯，ELB为苯甲酸乙酯，DMDS为二甲基二硫醚，DAS为二烯丙基一硫化物；数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 不同大写字母者表示差异极显著(P<0.01)。下同。

Notes: In this table DATS is Diallyl trisulfide,DADS is Diallyl disulfide,DBP is Dibutyl phthalate,ELB is Ethyl benzoate,DMDS is Dimethyl disulfide and DAS is Diallyl monosulfide;different lower-case and capital letters in the same column, respectively indicate the significant difference (P<0.05)and very significant difference (P<0.01). The same as below.

表3 不同质量浓度化合物标准品对病原物孢子萌发的抑制作用Table 3 Inhibiton of different concentrations standard compounds on the germination of pathogen spores

3 结论与讨论

经GC-MS检测，大蒜鳞茎浸提液中主要含有6种活性成分，其对苹果炭疽病菌丝生长和孢子萌发均具有抑制活性。其中，二烯丙基三硫化物和二甲基二硫醚抑制活性最强。

大蒜鳞茎浸提液6种主要成分中，二烯丙基三硫化物、二甲基二硫醚、二烯丙基二硫化物以及二烯丙基一硫化物广泛存在于葱蒜类产品中，其对真菌、细菌等具有抑杀效应，是天然的抗菌物质[8]。如杨静美等[9]报道，100 μL 和200 μL二甲基二硫醚处理对香蕉枯萎病菌的抑菌效果可达100%。含硫化合物抑菌作用的机理可能是通过氧化巯基，使与微生物生长繁殖相关的含硫巯基的酶失活，从而影响微生物生长繁殖，对病原物起到抑制或杀灭作用[10]。

邻苯二甲酸二丁酯是一种植物源物质，在辣椒[11]、花生[12]、百合[13]、人参[14]的根系分泌物中均可分离鉴定出来，其对微生物生长具有抑制或促进作用。张文明等[15]研究发现，邻苯二甲酸二丁酯可以明显促进马铃薯立枯病病原物立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的生长。周宝利等[16]报道，0.5 mmol·L-1的邻苯二甲酸二丁酯对茄子根际黄萎病菌的增殖具有较好的抑制作用。本研究结果表明，邻苯二甲酸二丁酯对苹果炭疽病菌丝生长具有低质量浓度促进高质量浓度抑制的作用，说明邻苯二甲酸二丁酯可能作为一种外源物刺激了病原物菌丝的生长。

从植物资源所含的天然物质中筛选具有拮抗真菌病害的有效成分，对于发现先导化合物，寻找与开发天然杀菌剂对病害进行无害化防治具有重要意义。植物中的许多天然活性成分具有抗菌作用，这些成分在抵御病原物侵染中具有潜在的生理功能，但一般来说，植物资源中的活性成分表现出的抗菌作用是多种化合物协同作用的结果[17-20]。