下调miR-32-5p表达对顺铂耐药肺癌细胞化疗敏感性的影响及其机制

史明，陈兴，李丁

本溪市中心医院，辽宁本溪117000

肺癌是世界范围内发病率和病死率增长最快的恶性肿瘤[1]。化疗是肺癌的常用治疗方法，尤其是中晚期肺癌。含顺铂(DDP)的化疗方案是肺癌手术切除后的一线辅助治疗策略，但在化疗过程中会产生耐药现象，最终导致化疗失败[2]。DDP化疗耐药的分子机制尚不完全清楚。因此，探索DDP化疗耐药的分子机制，对提高DDP化疗效果，改善肺癌患者预后具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，在细胞增殖、分化、凋亡及机体生长、发育等生理过程中发挥重要作用，其异常表达能够参与肿瘤、心血管疾病、糖尿病等疾病的发生、发展[3～5]。近年研究发现，miRNA在多种肿瘤化疗耐药过程中发挥重要的调节作用[6，7]。miR-32-5p是miRNA家族成员之一，其异常表达能够促进宫颈癌、胰腺癌细胞的增殖和迁移能力[8，9]。有研究发现，miR-32-5p过表达能够促进肝癌细胞多药耐药[10]。在前列腺癌细胞中，miR-32-5p表达下调能够提高肿瘤细胞对DDP的化疗敏感性[9]。这些研究表明，miR-32-5p可能参与调控肿瘤的化疗耐药。2016年6月～2019年3月，本研究探讨了下调miR-32-5p表达对DDP耐药肺癌细胞化疗敏感性的影响及其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌细胞系A549、SPC-A-1、H226(以下分别称A549、SPC-A-1、H226细胞)和人正常肺支气管上皮细胞系BEAS2B(以下称BEAS2B细胞)，购自美国ATCC细胞库。DDP，购自美国Sigma公司。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。miR-32-5p inhibitor与miR-32-5p mimic、pGLO-TCF21-野生型质粒(wt)与pGLO-TCF21-突变型质粒(mut)，购自美国Santa Cruz公司。NanoDrop 2000超微量分光光度计、K3型酶标仪，购自美国Thermo公司；7500型实时荧光定量PCR仪、流式细胞仪，购自美国ABI公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit，购自日本TaKaRa公司；One Step RT-PCR Kit，购自德国QIAGEN公司。MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；双荧光素酶活性检测试剂盒，购自上海泽叶生物科技有限公司。兔抗人Bax、Bcl-2多克隆抗体和GAPDH兔单克隆抗体及HRP标记的羊抗兔IgG二抗，购自英国Abcam公司。

1.2 细胞传代培养 将A549细胞接种于含10% FBS的DMEM/F12完全培养基中，将SPC-A-1、H226、BEAS2B细胞接种于含10% FBS的RPMI 1640完全培养基中，均置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养，每2天更换一次培养基。当细胞融合度为95%左右时，按1∶3传代。选择传2代、对数生长期、生长状态良好细胞进行后续实验。

1.3 人肺癌细胞与正常肺支气管上皮细胞miR-32-5p表达检测 采用RT-qPCR法。取A549、SPC-A-1、H226、BEAS2B各一皿(约2×106个),采用TRIzol法提取细胞总RNA，经NanoDrop 2000超微量分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明，将总RNA逆转录为cDNA。逆转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 30 s。以cDNA为模板，按One Step RT-PCR Kit说明进行PCR扩增。引物序列：miR-32-5p上游引物5′-CGGTATTGCACATTACTAAGTTGCA-3′，下游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应体系共25 μL：25×One Step RTase mix 1 μL，5×One Step RT Premix Buffer 5 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 15 μL；反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共40个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。选择miR-32-5p相对表达量最高的人肺癌细胞进行后续实验。

1.4 DDP耐药肺癌细胞系构建及其miR-32-5p表达检测 ①DDP耐药肺癌细胞系构建：选择miR-32-5p相对表达量最高的人肺癌细胞，采用药物持续接触、浓度递增诱导法筛选DDP耐药肺癌细胞。最终肺癌细胞在含20 μg/mL DDP的DMEM/F12完全培养基中稳定生长。故选择含20 μg/mL DDP的DMEM/F12完全培养基培养人肺癌细胞。取传2代、对数生长期、生长状态良好的人肺癌细胞及其DDP耐药细胞，以1×103个/孔接种于96孔板，加入含10% FBS的DMEM/F12完全培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养12 h，待细胞贴壁后，分别加入0、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL DDP，每个浓度设6个复孔。继续培养48 h，弃去培养基，加入含20 μL MTS、10% FBS的DMEM/F12培养基100 μL，37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱孵育2 h。采用K3型酶标仪检测各孔490 nm波长处的OD值，计算细胞存活率和DDP半数抑制浓度(IC50)。细胞存活率=实验孔OD490值/对照孔OD490值×100%，DDP IC50为细胞存活率为50%时所对应的DDP浓度。②DDP耐药肺癌细胞miR-32-5p表达检测：采用RT-qPCR法。取人肺癌细胞及其DDP耐药细胞各一皿(约2×106个)，按照1.3方法检测miR-32-5p相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.5 DDP耐药肺癌细胞转染与转染效率验证 取上述DDP耐药肺癌细胞，以2×105个/孔接种于6孔板，加入含20 μg/mL DDP的DMEM/F12完全培养基，随机分为观察组和对照组，然后置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养8～10 h，当细胞融合度为30%左右时，按Lipofectamine2000说明，观察组与对照组分别转染miR-32-5p inhibitor、NC inhibitor。12 h后更换含20 μg/mL DDP的DMEM/F12完全培养基继续培养。收集转染48 h细胞，按照1.3方法检测miR-32-5p相对表达量。每组设3个复孔。实验重复3次，取平均值。

1.6 下调miR-32-5p表达对DDP耐药肺癌细胞DDP敏感性的影响 收集两组上述转染24 h细胞，以1×103个/孔接种于96孔板，加入含20 μg/mL DDP的DMEM/F12完全培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养12 h，待细胞贴壁后，按1.4方法分别加入相应浓度的DDP，同法检测细胞存活率和DDP IC50。

1.7 下调miR-32-5p表达对DDP耐药肺癌细胞凋亡的影响 收集两组上述转染24 h细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，加入含20 μg/mL DDP的DMEM/F12完全培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养48 h，按Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明，加入结合缓冲液500 μL重悬细胞，然后加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 5 μL混匀，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 下调miR-32-5p表达对DDP耐药肺癌细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 收集两组上述转染24 h细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，加入含20 μg/mL DDP的DMEM/F12完全培养基培养。收集培养48 h细胞，加入RIPA裂解液充分裂解，提取细胞总蛋白，经BCA法蛋白定量合格后，加入5×上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白50 μg，SDS-PAGE(10%浓缩胶、5%分离胶)分离蛋白。电泳结束，采用电转移法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入兔抗人Bax、Bcl-2多克隆抗体和GAPDH兔单克隆抗体(稀释比均为1∶500)，4 ℃孵育过夜。次日，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(稀释比为1∶8 000)，室温孵育1 h，增强型化学发光液发光，暗室中曝光、显影。采用Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.9 miR-32-5p靶向调控TCF21验证 通过TargetScan7.2软件(http：//www.targetscan.org/)预测miR-32-5p的靶基因。取DDP耐药肺癌细胞，以3×103个/孔接种于96孔板，加入含20 μg/mL DDP的DMEM/F12完全培养基，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。随机将细胞分为miR-32-5p mimic-TCF21-wt组、miR-32-5p inhibitor-TCF21-wt组、miR-32-5p mimic-TCF21-mut组、miR-32-5p inhibitor-TCF21-mut组，每组设3个复孔。培养12 h，miR-32-5p mimic-TCF21-wt组加入miR-32-5p mimic、pGLO-TCF21-wt转染，miR-32-5p inhibitor-TCF21-wt组加入miR-32-5p inhibitor、pGLO-TCF21-wt转染，miR-32-5p mimic-TCF21-mut组加入miR-32-5p mimic、pGLO-TCF21-mut转染，miR-32-5p inhibitor-TCF21-mut组加入miR-32-5p inhibitor、pGLO-TCF21-mut转染。转染48 h，弃去培养基，收集细胞，加入细胞裂解液充分裂解，按双荧光素酶活性检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 人肺癌细胞与正常肺支气管上皮细胞miR-32-5p表达比较 A549、SPC-A-1、H226细胞miR-32-5p相对表达量分别为10.49±0.88、6.52±0.63、4.03±0.74，BEAS2B细胞miR-32-5p相对表达量为1.00±0.02。A549、SPC-A-1、H226细胞miR-32-5p相对表达量均高于BEAS2B细胞(t分别为15.84、9.51、6.25，P均<0.05)，且A549细胞miR-32-5p相对表达量高于SPC-A-1、H226细胞(t分别为2.87、4.98，P均<0.05)。故选择A549细胞进行后续实验。

2.2 A549细胞与DDP耐药A549细胞DDP IC50比较 经0、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL DDP作用48 h，A549细胞存活率分别为(100.00±1.01)%、(77.68±2.52)%、(67.637±5.52)%、(58.33±0.58)%、(49.21±2.52)%、(40.67±1.53)%、(35.29±5.03)%、(26.85±6.03)%、(19.32±6.03)%、(10.39±2.52)%，DDP耐药A549细胞存活率分别为(100.00±2.01)%、(97.34±5.61)%、(95.34±2.08)%、(84.67±3.01)%、(77.24±2.65)%、(65.33±5.51)%、(51.04±0.09)%、(43.95±5.29)%、(36.67±3.21)%、(31.19±2.01)%。A549细胞的DDP IC50为(2.92±0.18)μg/mL，DDP耐药A549细胞为(15.47±3.01)μg/mL。DDP耐药A549细胞DDP IC50高于A549细胞(t=8.63，P<0.05)。

2.3 A549细胞与DDP耐药A549细胞miR-32-5p表达比较 A549细胞与DDP耐药A549细胞miR-32-5p相对表达量分别为1.00±0.03、12.35±2.87。DDP耐药A549细胞miR-32-5p相对表达量明显高于A549细胞(t=9.54，P<0.05)。

2.4 两组miR-32-5p表达比较 观察组与对照组miR-32-5p相对表达量分别为0.27±0.08、1.00±0.05。观察组miR-32-5p相对表达量明显低于对照组(t=7.34，P<0.05)。

2.5 两组DDP IC50比较 经0、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL DDP作用48 h，对照组细胞存活率分别为(100.00±1.00)%、(96.48±3.21)%、(86.24±2.68)%、(82.11±1.95)%、(78.34±3.86)%、(66.57±7.10)%、(50.27±2.08)%、(46.95±7.94)%、(36.07±4.36)%、(33.14±1.15)%，观察组细胞存活率分别为(100.00±0.61)%、(92.30±2.08)%、(81.67±2.89)%、(73.42±5.69)%、(70.43±7.02)%、(55.36±8.66)%、(39.25±8.51)%、(36.08±7.21)%、(26.43±5.67)%、(21.30±7.31)%。对照组DDP IC50为(16.22±2.54)μg/mL，观察组为(7.43±1.25)μg/mL。观察组DDP IC50明显低于对照组(t=13.11，P<0.05)。

2.6 两组细胞凋亡率比较 观察组与对照组细胞凋亡率分别为(7.69±0.24)%、(2.35±0.18)%。观察组细胞凋亡率高于对照组(t=6.84，P<0.05)。

2.7 两组Bax、Bcl-2蛋白表达比较 观察组与对照组Bax蛋白相对表达量分别为4.06±0.13、1.00±0.02，Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.34±0.09、1.00±0.05。观察组Bax蛋白相对表达量高于对照组，Bcl-2蛋白相对表达量低于对照组(t分别为5.28、9.54，P均<0.05)。

2.8 miR-32-5p对TCF21的靶向调控验证结果 TargetScan7.2软件在线预测显示，TCF21启动子区与miR-32-5p具有结合位点，见图1。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-32-5p mimic-TCF21-wt组、miR-32-5p inhibitor-TCF21-wt组、miR-32-5p mimic-TCF21-mut组、miR-32-5p inhibitor-TCF21-mut组荧光素酶活性分别为1.00±0.07、0.35±0.04、1.00±0.04、0.92±0.11。miR-32-5p mimic-TCF21-wt组荧光素酶活性低于miR-32-5p inhibitor-TCF21-wt组(t=5.27，P<0.05)，而miR-32-5p mimic-TCF21-mut组与miR-32-5p inhibitor-TCF21-mut组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(t=1.93，P>0.05)。

图1 miR-32-5p与TCF21启动子区结合位点示意图

3 讨论

癌症是造成人类疾病死亡的主要原因之一。据估计，到2030年全球死于癌症的人数预计达到1 350万例[10]。肺癌是世界范围内发病率和病死率增长最快的恶性肿瘤[1]。肺癌首选治疗策略为外科手术，但由于多数患者确诊时已处于中晚期，失去了根治性切除机会。对于无法切除的中晚期肺癌，以DDP为基础的联合化疗是其标准一线方案，但长期用药可引起肿瘤细胞的耐药性，导致化疗失败[11，12]。因此，探索与DDP化疗耐药相关的分子对肺癌治疗具有重要意义。

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，能够参与细胞增殖、分化、凋亡及机体生长、发育等生理过程[3]，还能调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等病理过程[13]。近年研究发现，miRNA还能参与调控肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性和耐药性[4]。miR-32-5p是miRNA家族成员之一。Zhu等[14]首次报道，暴露于高血糖的间充质干细胞miR-32-5p表达下调。近年研究发现，miR-32-5p还能参与多种肿瘤的发生、发展。在宫颈癌细胞中miR-32-5p表达下调，上调miR-32-5p表达能够抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移[8]。在胰腺癌细胞中miR-32-5p表达上调，下调miR-32-5p表达能够抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移[9]。结果表明，miR-32-5p可能具有双重作用，既可作为促癌因子又可作为抑癌因子。有研究发现，miR-32-5p在前列腺癌、肝癌细胞中表达上调，其表达上调与肿瘤细胞的化疗耐药密切相关[9，10]。但目前miR-32-5p在肺癌细胞中的作用尚不清楚。

本研究首先观察了miR-32-5p在肺癌A549、SPC-A-1、H226细胞及正常肺支气管上皮BEAS2B细胞中的表达，结果发现A549、SPC-A-1、H226细胞miR-32-5p表达明显高于BEAS2B细胞，以A549细胞表达最高，故选择A549细胞进行后续实验。通过药物持续接触、浓度递增诱导法筛选DDP耐药A549细胞，经MTS法验证DDP耐药A549细胞DDP IC50高于A549细胞，表明DDP耐药A549细胞构建成功。经RT-qPCR法验证，DDP耐药A549细胞miR-32-5p相对表达量明显高于A549细胞，提示miR-32-5p表达与肺癌DDP耐药有关。下调DDP耐药A549细胞miR-32-5p表达后，观察组DDP IC50明显低于对照组，表明下调miR-32-5p表达能够提高DDP耐药A549细胞对DDP的敏感性。进一步研究发现，观察组细胞凋亡率高于对照组；观察组Bax蛋白相对表达量高于对照组，Bcl-2蛋白相对表达量低于对照组。提示下调miR-32-5p表达能够通过调控Bax/Bcl-2，增强DDP介导的DDP耐药A549细胞凋亡。

miRNA虽然不能直接编码蛋白质，但可通过结合靶基因mRNA的3′UTR抑制翻译或降解mRNA发挥负性调控作用[4，5]。目前，miR-32-5p已确定的靶基因有HOXB8、BIX、PTEN等[10]。本研究采用TargetScan7.2软件预测发现，TCF21的3′UTR区域存在miR-32-5p的结合位点。因此，TCF21也是miR-32-5p的靶基因。TCF21基因定位于人染色体6q23～q24区域，可编码Ⅱ类基本螺旋-环-螺旋转录因子，该因子可调节间充质细胞向上皮细胞的转化。因此，TCF21被认为是一种候选肿瘤抑制因子[15]。本研究双荧光素酶报告基因实验显示，miR-32-5p mimic-TCF21-wt组荧光素酶活性低于miR-32-5p inhibitor-TCF21-wt组，而miR-32-5p mimic-TCF21-mut组与miR-32-5p inhibitor-TCF21-mut组荧光素酶活性比较差异无统计学意义，提示miR-32-5p能够靶向负性调控TCF21。但miR-32-5p参与DDP耐药肺癌细胞化疗敏感性具体的分子机制还需要进一步研究。

综上所述，下调miR-32-5p表达能够提高DDP耐药肺癌细胞的化疗敏感性，其机制与靶向调控TCF21能够促进Bax蛋白表达、抑制Bcl-2蛋白表达，从而提高细胞凋亡率有关。miR-32-5p有可能成为DDP耐药肺癌潜在的治疗靶点。