Q开关NYAG 1 064 nm激光对表皮葡萄球菌活性及结构的影响

谈桂其， 钟静， 翁智胜, 彭洁雯， 李晓辉， 廖梦怡， 易江华， 辛甜甜

(广州医科大学附属第三医院皮肤科， 广东 广州 510150)

1 对象与方法

1.1 标本来源及培养基

表皮葡萄球菌病原体来源于我院皮肤科门诊毛囊炎患者，临床表现典型，结合病原学检查，诊断符合《皮肤性病学》细菌性毛囊炎诊断标准[4]。

培养基: 胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板(TSA)，Leeming-Notman培养基。

1.2 主要仪器

Q开关掺钕钇铝石榴石激光治疗仪(长春佳技光电科技有限公司，型号JJ-10A)，透射电子显微镜(HITACHI，型号：HT7700)。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株鉴定 选取毛囊炎患者脓疱，75%酒精消毒表面，用无菌针头挑破脓疱，用力挤出脓液并挑取至TSA、Leeming-Notman培养基，用无菌接种环划线接种，放置37 ℃恒温培养箱中培养1周。仅见TSA培养基上菌落长出，取单一菌落进行基因测序鉴定。

1.3.2 实验分组及操作 选择二次传代菌体，挑取单一菌落于玻片上，予10 μL无菌生理盐水稀释，均匀涂平，待自然干燥，分为实验组与对照组。实验组：激光光斑直径2 mm，脉宽≤8 ns，以500、600、700、800、900 mJ(即能量密度为15.9、19.1、22.2、25.4、28.7 J/cm2)照射菌体，分别为A、B、C、D、E组；对照组不予激光照射。实验组与对照组共6组，各组均10个标本。

1.3.3 菌体活性测定 集落形成试验[5]：激光照射后将每组菌体用无菌生理盐水洗脱并收集于EP管中，摇匀制成菌悬液，采用血细胞计数板计算每组菌悬液浓度，调整至相同浓度后划线接种于TSA，37 ℃恒温箱培养7天，每日观察、计算菌落数，比较各组间菌落数。

1.3.4 透射电镜观察 将每组菌体用无菌生理盐水洗脱并收集于EP管中，离心去上清液，加入固定液，再经后固定、脱水、渗透、包埋、切片、染色，最后透射电镜下观察，采集图像分析。

1.4 统计学处理

利用SPSS 26.0统计软件分析数据。各组菌落数以均数±标准差表示。多组间菌落数比较采用单因素方差分析;对照组与各实验组菌落数比较采用t检验；实验组激光能量与菌落数的关系采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株鉴定

经16SrRNA 基因扩增，测序结果与BLAST 比对显示表皮葡萄球菌株(GenBank No.NR_113957.1)100%。

2.2 菌体活性

集落形成试验：培养7天后各组培养基上均可见菌落，对照组菌落数最多，实验组菌落数明显减少。各组菌落数详见表1。经统计比较，6组菌落数差异有统计学意义(F=1 536.97，P<0.05)；对照组与实验A、B、C、D、E组比较，差异均有统计学意义(t值分别为7.28、35.20、48.74、57.37、63.58，P值均<0.05)。激光能量与菌落数呈高度负相关(r=-0.90，P<0.05)。

2.3 透射电镜观察

实验组和对照组均可见细胞壁表面分布大量絮状物(多糖、脂类及蛋白)，细胞膜皱缩、破裂，质壁分离，原生质浓缩，细胞器结构模糊。对照组细胞壁完整，厚度不均匀，平均厚度64 nm。实验组中：A组细胞壁局部明显增生，平均厚度183 nm；B组细胞壁局部明显增生，平均厚度115 nm，细胞膜大面积消失；C组细胞壁平均厚度70 nm，细胞膜小面积溶解，胞内可见高电子密度颗粒聚集，细胞基质溶解；D组细胞壁结构模糊，平均厚度69 nm，细胞膜小面积溶解，胞内可见高电子密度颗粒聚集，细胞基质溶解；E组细胞壁结构模糊，平均厚度92 nm，细胞膜大面积溶解，胞内可见高电子密度颗粒聚集，细胞基质溶解。详见图1、图2A～2E。

表1 不同能量激光照射后各组菌落数对比

图1对照组:细胞壁完整；细胞膜皱缩；细胞基质无异常 图2实验组2A：细胞壁粗糙；细胞膜皱缩；细胞基质无异常；2B:细胞壁粗糙；大面积细胞膜消失；细胞基质无异常;2C：细胞壁粗糙,结构模糊；小面积细胞膜溶解；细胞基质溶解;2D:细胞壁粗糙,结构模糊；小面积细胞膜溶解；细胞基质溶解;2E:细胞壁粗糙,结构模糊；大面积细胞膜溶解；细胞基质溶解

Fig.1Control group: the cell wall was complete.The cell membrane was wrinkled.The cell matrix was normal.Fig.2Treatment group.2A:The cell wall was rough.The cell membrane was wrinkled.The cell matrix was normal;2B: The cell wall was rough.A large area of cell membrane disappeared.The cell matrix was normal;2C: The cell wall was rough with fuzzy structure.A small area of cell membrane was dissolved.The cell matrix was dissolved;2D: The cell wall was rough with fuzzy structure.A small area of cell membrane was dissolved.The cell matrix was dissolved;2E: The cell wall was rough with fuzzy structure.A large area of cell membrane was dissolved.The cell matrix was dissolved.

3 讨论

表皮葡萄球菌是临床上最常见的凝固酶阴性的葡萄球菌，是一种条件致病菌，一般粘附于人体的皮肤和粘膜，是毛囊炎致病菌之一[1]。本研究的表皮葡萄球菌来源于临床符合毛囊炎表现患者，马拉色菌培养基阴性,并经基因测序证实。表皮葡萄球菌性毛囊炎临床上主要外用或口服抗生素治疗，但随着临床抗生素的广泛使用、甚至滥用，其耐药现象日益严重，给治疗带来困难[6-7]。